[發明專利]基于蛋白結合誘導DNA雙鏈變構的檢測色氨酸的方法

有效

• 申請號: 201811245536.4
• 申請日: 2018-10-24
• 公開（公告）號: CN109406469B
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 趙國杰
• 申請（專利權）人: 中國醫科大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標代理有限公司 21107
• 代理人: 史力伏

本發明涉及生物化學、分子生物學、氨基酸成分確認的檢測方法，具體涉及一種基于蛋白結合誘導DNA雙鏈變構的檢測左旋色氨酸的方法。利用色氨酸結合的阻遏蛋白，結合含有識別序列和切刻位點的DNA雙鏈，并使含有識別序列和切刻位點的DNA雙鏈變構，從而引起雙鏈所在的分子信標發射熒光。根據熒光信號的強弱，定量的測定色氨酸的濃度。該方法為檢測色氨酸提供了一種新的簡便，快速，可定量的技術，在科學研究和生物樣品的氨基酸檢測領域具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明涉及生物化學、分子生物學、氨基酸成分確認的檢測方法，具體涉及一種基于蛋白結合誘導DNA雙鏈變構的檢測左旋色氨酸的方法。

背景技術

左旋色氨酸（L-Trp）是構成蛋白質的20種天然氨基酸之一，是人體的8種必需氨基酸之一。作為重要的營養物質，許多的食物（原料、半成品、產品等）、飲料和調味品、飼料中都含有色氨酸。如何方便、快捷和準確的對色氨酸進行定量分析在食品和飼料等生物制品的檢測中具有重要意義。

色氨酸在生物體內除了作為原料合成蛋白質外，其很多代謝產物具有重要的生物學功能及意義。人體內的色氨酸主要通過兩種途徑代謝：血清素途徑和犬尿氨酸途徑。在血清素代謝途徑即5-羥色胺途徑中，首先色氨酸羥化酶催化色氨酸生成5-羥色氨酸，然后在脫羧酶作用下5-羥色氨酸生成5-羥色胺。在犬尿氨酸途徑中，吲哚胺2,3雙加氧酶（IDO）和色氨酸2,3雙加氧酶（TDO）催化色氨酸生成N-甲酰犬尿氨酸。代謝過程中產生的5羥色胺是一種重要的神經遞質，參與神經系統的眾多生理功能的調節。犬尿喹啉酸是一種興奮性氨基酸受體的拮抗劑。色氨酸代謝途徑的異常可以引起體液中色氨酸濃度的變化。因此，對色氨酸濃度進行定量檢測具有重要的生物學研究和健康檢測價值。

目前，最常用的檢測色氨酸的方法有HPLC法、質譜法、層析法、紫外吸收法、熒光光譜法等。但是，這些檢測分析方法均需要大型專業分析儀器設備，不僅需要專業人員來進行操作，而且對設備的使用和維護的要求也較高。目前，不依賴于大型儀器設備的可用于檢測色氨酸的試劑盒常用的有ELISA法，該方法利用色氨酸抗體與色氨酸的結合檢測色氨酸，雖然降低了對大型專業儀器設備的要求，但是該檢測方法需要包被、鋪板、加樣、加抗體、顯色以及各步之間的多次洗滌操作，步驟繁瑣，易于出現人為誤差。此外，也有利用滾環擴增檢測的方法，然而依賴酶促反應，影響因素復雜，而且不能進行“開啟式”檢測。因此，開發新的檢測方法，實現簡便、快捷、特異性高、性價比高的色氨酸一步檢測技術具有重要的意義。

發明內容

鑒于現有技術存在的缺陷，本發明提出一種基于蛋白結合誘導DNA雙鏈變構的全新的檢測左旋色氨酸的方法，含有切刻位點的DNA雙鏈被莖環結構固定在彎折狀態，通過色氨酸誘導的蛋白結合，將彎折DNA雙鏈變為直鏈，并打開莖環結構，通過該方法可以實現左旋色氨酸的簡便、快捷、一步、可定量的檢測。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案。

一種基于蛋白結合誘導DNA雙鏈變構的檢測左旋色氨酸的方法，其特征在于包括下述步驟：待檢測的左旋色氨酸與色氨酸阻遏蛋白結合，結合了左旋色氨酸的色氨酸阻遏蛋白，通過識別并結合含有特異性識別序列和切刻位點的DNA雙鏈，使DNA分子信標打開，發射熒光，熒光強度與左旋色氨酸的濃度成正比，通過與左旋色氨酸標準樣品的熒光強度比較，測定出待測樣品中的左旋色氨酸含量。

所述的待檢測的左旋色氨酸是制備的左旋色氨酸溶液，或是各種提取的含有左旋色氨酸的生物樣本。

所述的色氨酸阻遏蛋白是細胞中調控色氨酸操縱子基因表達的阻遏蛋白trpR，左旋色氨酸特異性結合該蛋白能夠提高該蛋白結合色氨酸操縱子識別序列的親和力。

所述的DNA雙鏈，具有切刻位點，并能夠形成分子信標，并含有色氨酸阻遏蛋白的識別序列。

與現有技術相比，本發明采用蛋白結合誘導DNA雙鏈變構的全新的檢測左旋色氨酸的方法具有下列優點。