[發明專利]一種長效EPO活性檢測方法

在審

• 申請號: 201811243629.3
• 申請日: 2018-10-24
• 公開（公告）號: CN109470627A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 王笑非;楊威;梁桂嬋;葉才果;鄧新宇
• 申請（專利權）人: 廣東省生物資源應用研究所;佛山安普澤生物醫藥股份有限公司
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

本發明公開了一種長效EPO活性檢測方法。設置生理鹽水組為空白組，短效EPO組為對照組，待測藥物組，分別將生理鹽水、短效EPO和待測藥物對小鼠進行皮下注射，定期采集血液；然后用流式細胞儀檢測血液中網織紅細胞含量，并計算網織紅細胞的百分率；和/或用細胞計數儀檢測血液中血細胞的數量，計算血細胞中含有的網織紅細胞的數量；通過網織紅細胞含量和/或網織紅細胞的數量來判定待測藥物是否為長效EPO。本發明克服了上述缺陷，將待測藥物注入小鼠體內，對血液中的網織紅細胞含量和/或網織紅細胞的數量進行判斷，從而來判斷待測藥物是否為長效EPO的，其操作簡單，準確。

技術領域

本發明屬于藥物活性檢測領域，具體涉及一種長效EPO活性檢測方法。

背景技術：

促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)是特異作用于紅系祖細胞增殖、分化并成熟為紅細胞的糖蛋白類造血生長因子，分子量30.4kD，由165個氨基酸組成，其中約占分子量40％的糖鏈在EPO生物合成、結構穩定、體內活性發揮很重要的作用。在全球范圍內，有短效EPO和長效EPO之分。短效EPO的血清半衰期較短，臨床給藥次數為每周2-3次，給藥頻繁。長效EPO的血清半衰期可以達到兩周，臨床給藥次數為一周到兩周1次(取決于疾病和進程的不同)。我國已經獲批的EPO產品均為短效，尚沒有長效EPO的上市，而長效EPO在國外已經上市超過10年。我國長效EPO尚處于臨床試驗和臨床前研究階段。

EPO生物學活性與其在體內的半衰期密切相關。EPO生物學活性測定方法分體外法和體內法。因為現今我國醫藥市場主要以短效EPO為主，現階段體內生物學活性檢測方法也主要針對短效EPO，而針對長效EPO的體內活性的檢測方法暫鮮見，因此無法判斷研發的EPO是否具有長效性。

因此開發本方法用于檢測判斷EPO長短效性。

發明內容：

本發明的目的是提供一種長效EPO活性檢測方法，該方法解決了現有技術中的空缺和存在的問題，且操作簡單、準確。

本發明的長效促紅細胞生成素(EPO)活性檢測方法，包括以下步驟：

a、設置生理鹽水組為空白組，短效EPO組為對照組，待測藥物組，分別將生理鹽水、短效EPO和待測藥物對小鼠進行皮下注射，定期采集血液；

b、然后用流式細胞儀檢測血液中網織紅細胞含量，并計算網織紅細胞的百分率；和/或用細胞計數儀檢測血液中血細胞的數量，計算血細胞中含有的網織紅細胞的數量；

通過網織紅細胞含量和/或網織紅細胞的數量來判定待測藥物是否為長效EPO。

優選，所述的定期采集血液是定期進行尾靜脈取血。

進一步優選，所述的定期進行尾靜脈取血是每天進行尾靜脈取血。

EPO注射到小鼠體內后，短效EPO組在第5天網織紅細胞含量(Ret％)恢復至正常小鼠水平；而長效EPO組，小鼠Ret％在注射后第7天仍比對照組高，則可判定待測藥物為長效EPO。

計算公式：

Ret％＝(網織紅細胞數量/紅細胞數量)*100％。

從第7天開始，由于前面幾天EPO促進網織紅細胞增多，最終成熟為紅細胞(需要時間約為24-48小時)的絕對數量也增多。通過細胞計數儀對空白組、短效EPO和待測藥物組的血細胞計數，計算小鼠血液中網織紅細胞的絕對數量。網織紅細胞的絕對數量的多少也可判定待測藥物是否為長效EPO。

計算公式：

Ret數量＝紅細胞數量*Ret％