[發明專利]一種篩選能應用于流式細胞術抗體的方法

在審

• 申請號: 201811242616.4
• 申請日: 2018-10-24
• 公開（公告）號: CN109517058A
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發明（設計）人: 魯亮;雷坤;秦伏波;張永霞
• 申請（專利權）人: 普健生物（武漢）科技有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C12N15/70;C12N15/13;G01N15/14;G01N33/53
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 徐瑛;祝蓉蓉

本發明公開一種篩選能應用于流式細胞術抗體的方法，包括以下步驟：(1)抗原表達及純化，所述抗原包括免疫抗原、篩選抗原、流式篩選抗原；(2)小鼠免疫，篩選效價高的小鼠做細胞融合；(3)預實驗處理，獲取通透處理的細胞，所述細胞可表達MATX?GFP?His蛋白；(4)細胞融合和篩選；(5)亞克??；(6)抗體生產。通過預實驗設計確定二抗來源及其工作濃度，以簡化操作，避免篩選過程中的背景干擾，減少工作量，提高工作效率，篩選周期短，適應于流式細胞術抗體的快速篩選。

技術領域

本發明屬于流式抗體篩選領域，具體涉及一種篩選能應用于流式細胞術抗體的方法。

背景技術

流式細胞術(Flow Cytometry，FCM)：是一種對液流中排成單列的細胞或其它生物微粒(如微球，細菌，小型模式生物等)逐個進行快速定量分析和分選的技術。流式細胞術具有速度快、精度高、準確性好等優點，是非常先進的細胞定量分析技術。該技術被廣泛的應用于細胞生物學、免疫學、血液學、腫瘤學、藥理學、遺傳學及臨床檢驗等多個領域，如細胞周期、細胞凋亡、細胞活力的檢測，淋巴細胞亞群與疾病的關系研究，器官移植后的免疫學監測，腫瘤的特異性指標的檢測，藥物作用機制研究，篩選新藥等等。隨著流式細胞術應用領域的日益廣泛，流式抗體及熒光標記產品的種類、數量也在不斷增多，加上多色分析實驗方案需求的增長，對抗體的流式細胞術的應用要求日趨增加。目前各大商業抗體公司開發抗體主要以wb，IF，IHC應用為主，而流式細胞儀操作繁瑣，儀器維護昂貴，篩選通量限制的因素，極大限制了抗體流式應用的開發。

申請號為CN201810143471.6的專利公開了一種利用流式細胞分選篩選納米抗體的方法，所述方法步驟包括：(1)收集被免疫靶抗原的駱駝科動物的外周血B淋巴細胞；(2)應用靶抗原通過流式細胞術分選所述B淋巴細胞為單細胞；(3)將分選好的單個B淋巴細胞直接進行逆轉錄反應生成cDNA；(4)以cDNA為模板，PCR擴增抗體重鏈序列并回收擴增產物；(5)以步驟(4)擴增產物為模板，PCR擴增抗體的CH1與CH2序列編碼基因；(6)以步驟(5)擴增為陰性的步驟(4)擴增產物為模板，PCR擴增抗體的VHH片段編碼基因；(7)將步驟(6)獲得的VHH片段克隆入表達載體，并在宿主菌中表達所述VHH片段；(8)鑒定步驟(7)表達的納米抗體，但是這種方法較為復雜，且需要建立庫容高、多樣性豐富的抗體文庫，易造成噬菌體污染。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術存在的問題，提供一種篩選能應用于流式細胞術抗體的方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種篩選能應用于流式細胞術抗體的方法，包括以下步驟：

(1)抗原表達及純化，所述抗原包括免疫抗原、篩選抗原、流式篩選抗原；所述抗原含有MATX的cDNA基因序列，所述cDNA的基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

(2)小鼠免疫，篩選效價高的小鼠做細胞融合；

(3)預實驗處理，獲取通透處理的細胞，所述細胞可表達MATX-GFP-His蛋白；所述MATX-GFP-His蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

(4)細胞融合和篩選；

(5)亞克?。?/p>

(6)抗體生產。

進一步的，所述步驟(1)的具體步驟為：

A、免疫抗原表達及純化：將MATX的cDNA基因序列利用限制性內切酶NcoI和XhoI雙酶切定向插入到E.coli pT7質粒中，得到免疫抗原表達載體質粒，將所述免疫抗原表達載體質粒轉入大腸桿菌進行表達獲得免疫抗原蛋白，并過鎳柱純化免疫抗原蛋白，所述免疫抗原載體質粒的N末端帶His標簽，所述免疫抗原載體質粒的堿基序列如序列表SEQ IDNO.3所示；