[發(fā)明專利]一種篩選能應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)抗體的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811242616.4
• 申請日: 2018-10-24
• 公開（公告）號: CN109517058A
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魯亮;雷坤;秦伏波;張永霞
• 申請（專利權(quán)）人: 普健生物（武漢）科技有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C12N15/70;C12N15/13;G01N15/14;G01N33/53
• 代理公司: 南京縱橫知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 徐瑛;祝蓉蓉

1.一種篩選能應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)抗體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)抗原表達(dá)及純化，所述抗原包括免疫抗原、篩選抗原、流式篩選抗原；所述抗原含有MATX的cDNA基因序列，所述cDNA的基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

(2)小鼠免疫，篩選效價(jià)高的小鼠做細(xì)胞融合；

(3)預(yù)實(shí)驗(yàn)處理，獲取通透處理的細(xì)胞，所述細(xì)胞可表達(dá)MATX-GFP-His蛋白，所述MATX-GFP-His蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

(4)細(xì)胞融合和篩選；

(5)亞克隆；

(6)抗體生產(chǎn)。

2.如權(quán)利要求1所述的一種篩選能應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)抗體的方法，其特征在于，所述步驟(1)的具體步驟為：

A、免疫抗原表達(dá)及純化：將MATX的cDNA基因序列利用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI雙酶切定向插入到E.coli pT7質(zhì)粒中，得到免疫抗原表達(dá)載體質(zhì)粒，將所述免疫抗原表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)獲得免疫抗原蛋白，并過鎳柱純化免疫抗原蛋白，所述免疫抗原載體質(zhì)粒的N末端帶His標(biāo)簽，所述免疫抗原載體質(zhì)粒的堿基序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

B、篩選抗原表達(dá)及純化：將MATX的cDNA基因序列利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切定向插入pATX1質(zhì)粒中，得到質(zhì)粒pATX1-6His-MATX，將質(zhì)粒pATX1-6His-MATX轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞表達(dá)獲得篩選抗原蛋白，并過鎳柱純化篩選抗原蛋白，所述質(zhì)粒pATX1-6His-MATX的N末端帶His標(biāo)簽和Kozak片段，所述質(zhì)粒pATX1-6His-MATX的堿基序列如序列表SEQ IDNO.4所示；

C、流式篩選抗原表達(dá)及純化：將MATX的cDNA基因序列利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切定向插入到pATX1-GFP質(zhì)粒中，得到質(zhì)粒pATX1-GFP-6His-MATX，然后轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞表達(dá)獲得流式篩選抗原蛋白，所述流式篩選抗原蛋白氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.5所示，所述pATX1-GFP-6His-MATX質(zhì)粒的N末端帶His標(biāo)簽、GFP標(biāo)簽、Kozak片段；

其中，所述免疫抗原蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，所述篩選抗原蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示。

3.如權(quán)利要求1所述的一種篩選能應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)抗體的方法，其特征在于，步驟(2)具體步驟為，將步驟(1)中獲得的抗原對小鼠進(jìn)行免疫，并進(jìn)行elisa效價(jià)和流式檢測篩選小鼠做細(xì)胞融合。

4.如權(quán)利要求1所述的一種篩選能應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)抗體的方法，其特征在于，步驟(3)包括預(yù)實(shí)驗(yàn)一和預(yù)實(shí)驗(yàn)二，所述預(yù)實(shí)驗(yàn)一用于確定二抗選擇及最適工作濃度，所述預(yù)實(shí)驗(yàn)二用以驗(yàn)證二抗最適工作濃度及流式細(xì)胞儀檢測參數(shù)設(shè)定,所述二抗包括Jackson抗體和Immunoreagent抗體。