[發明專利]一種基于液相色譜串聯質譜法檢測血清中25-羥基維生素D的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201811242571.0
• 申請日: 2018-10-24
• 公開（公告）號: CN109212090A
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發明（設計）人: 李艷;許舒欣;李小強;胡瑋;程文播;韓文念
• 申請（專利權）人: 天津國科醫工科技發展有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司 12211
• 代理人: 張月

1.一種基于液相色譜串聯質譜法檢測血清中25-羥基維生素D的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)取血清與內標工作液于樣品管中渦旋混勻；

(2)向混勻后的混合液中加入提取劑，渦旋混勻待凈化；

(3)待凈化的樣品在裝有填料的柱上上樣，待全部上樣浸潤后靜置；

(4)用洗脫劑進行洗脫；

(5)收集洗脫液，并用正壓裝置將殘余的液體壓下；

(6)將收集的洗脫液經氮氣吹干，加入復溶液復溶，渦旋一段時間后采用液相色譜串聯質譜法進行檢測，并通過比較25-羥基維生素D和25-羥基維生素D的內標峰面積來得出待測血清中25-羥基維生素D的含量。

2.根據權利要求1所述的基于液相色譜串聯質譜法檢測血清中25-羥基維生素D的方法，其特征在于：步驟(1)中，內標工作液包括25-羥基維生素D₂內標和25-羥基維生素D₃內標。

3.根據權利要求1所述的基于液相色譜串聯質譜法檢測血清中25-羥基維生素D的方法，其特征在于：步驟(1)中，血清的選用量為90-200μL，內標工作液的選用量為5-30μL，渦旋混勻時間為10s；步驟(2)中，提取劑的用量為90-300μL，渦旋混勻時間為50-120s；步驟(3)中，靜置時間為3-10min；步驟(4)中，洗脫液的用量為1-3mL,且洗脫液均分3-6次洗脫；步驟(6)中，復溶液的用量為90-200μL，渦旋時間為25-60s；優選的，步驟(1)中，血清的選用量為100μL，內標工作液的選用量為10μL，渦旋混勻時間為10s；步驟(2)中，提取劑的用量為100μL，渦旋混勻時間為60s；步驟(3)中，靜置時間為5min；步驟(4)中，洗脫液的用量為2mL,且洗脫液均分4次洗脫；步驟(6)中，復溶液的用量為100μL，渦旋時間為30s。

4.根據權利要求1所述的基于液相色譜串聯質譜法檢測血清中25-羥基維生素D的方法，其特征在于：步驟(2)中，提取劑為100mM的氫氧化鈉水溶液；步驟(4)-(6)中，洗脫劑為HPLC級異辛烷；步驟(6)中，復溶液為40～60v/v％的甲醇水溶液，洗針液為50～80v/v％的甲醇水溶液；優選的，步驟(6)中，復溶液為50v/v％的甲醇水溶液，洗針液為50v/v％的甲醇水溶液。

5.根據權利要求1所述的基于液相色譜串聯質譜法檢測血清中25-羥基維生素D的方法，其特征在于：步驟(6)中，液相色譜串聯質譜法檢測時的色譜條件如下：采用梯度洗脫程序，0.05～0.3v/v％的甲酸水溶液作為流動相A，0.05～0.3v/v％的甲酸甲醇溶液作為流動相B；優選的，梯度洗脫程序中流動相A采用0.1v/v％的甲酸水溶液，流動相B采用0.1v/v％的甲酸甲醇溶液。

6.根據權利要求5所述的基于液相色譜串聯質譜法檢測血清中25-羥基維生素D的方法，其特征在于：步驟(6)中，梯度洗脫的參數如下：

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7.根據權利要求1所述的基于液相色譜串聯質譜法檢測血清中25-羥基維生素D的方法，其特征在于：步驟(6)中，液相色譜串聯質譜法檢測時的色譜條件還包括：色譜柱：C182.1×100mm，3μm；色譜參數：流動相流速0.4-1.0mL/min，柱溫35-60℃，檢測時間4-10min，進樣量10-50μL；優選的，流動相流速為0.5mL/min，柱溫40℃；檢測時間7min，進樣量30μL。

8.根據權利要求1所述的基于液相色譜串聯質譜法檢測血清中25-羥基維生素D的方法，其特征在于：步驟(6)中，液相色譜串聯質譜法檢測時的質譜條件包括：

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