[發(fā)明專利]一種基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血清中25-羥基維生素D的方法及試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811242571.0
• 申請(qǐng)日: 2018-10-24
• 公開（公告）號(hào): CN109212090A
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李艷;許舒欣;李小強(qiáng);胡瑋;程文播;韓文念
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津國(guó)科醫(yī)工科技發(fā)展有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 天津?yàn)I海科緯知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12211
• 代理人: 張?jiān)?/td>

本發(fā)明提供了一種基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血清中25?羥基維生素D的方法及試劑盒，其中，血清中25?羥基維生素D液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，包括以下步驟：(1)取血清與內(nèi)標(biāo)工作液于樣品管中渦旋混勻；(2)向混勻后的混合液中加入提取劑，渦旋混勻待凈化；(3)待凈化的樣品全部上樣，待全部上樣浸潤(rùn)后靜置；(4)用洗脫劑進(jìn)行洗脫；(5)收集洗脫液，并用正壓裝置將殘余的液體壓下；(6)將收集的洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈桑尤霃?fù)溶液復(fù)溶，渦旋一段時(shí)間后采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明所述的血清中25?羥基維生素D液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，可提高檢測(cè)準(zhǔn)確度、精密度以及大大縮短前處理時(shí)間，并提高檢測(cè)通量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于25-羥基維生素D檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種可以同時(shí)檢測(cè)25-羥基維生素D₂和25-羥基維生素D₃的方法和試劑盒。

背景技術(shù)

維生素D有調(diào)節(jié)鈣磷代謝的經(jīng)典作用和影響細(xì)胞增殖分化等非經(jīng)典作用，是維持人體健康必不可少的一種類固醇激素。維生素D的缺乏時(shí)可導(dǎo)致兒童佝僂病和成年人軟骨癥。近年來(lái)，深入的研究表明維生素D缺乏會(huì)增加罹患腫瘤、心血管疾病、自發(fā)免疫性疾病和精神疾病等常見多發(fā)疾患的風(fēng)險(xiǎn)。基于維生素D對(duì)于人體健康的重要性和針對(duì)目前中國(guó)人群維生素D水平偏低的現(xiàn)狀，有必要在中國(guó)人群中普及維生素D水平檢測(cè)以及對(duì)重點(diǎn)人群進(jìn)行篩查。25-羥基維生素D(分為25-羥基維生素D₂和25-羥基維生素D₃)水平被定義為維生素D營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的功能指標(biāo)，已經(jīng)成為國(guó)際上公認(rèn)的衡量維生素D的最佳指標(biāo)。

目前常用的檢測(cè)25(OH)D含量的方法有競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合法(CPBA)、放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法(CLIA)、高效液相色譜法(HPLC)等。有的方法耗時(shí)、步驟冗雜，無(wú)法滿足臨床簡(jiǎn)便、高通量的要求；有的方法具有放射性污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境都有損害；有的方法容易與其他非目標(biāo)化合物發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致方法特異性不足，HPLC相對(duì)于免疫法可以區(qū)分開25(OH)D₂和25(OH)D₃，但是25(OH)D₂濃度太低，液相色譜法檢測(cè)限達(dá)不到要求。

隨著檢測(cè)技術(shù)及精度的發(fā)展，HPLC逐步被液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)所替代。LC-MS/MS是色譜法中最為常用的25(OH)D檢測(cè)方法，樣品經(jīng)處理后采用液相色譜分離，檢測(cè)器為串聯(lián)質(zhì)譜儀，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式下，可同時(shí)檢測(cè)25(OH)D₂和25(OH)D₃，具有非常高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，被國(guó)際公認(rèn)為25(OH)D檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。體內(nèi)維生素D濃度的準(zhǔn)確定量是診斷維生素D缺乏相關(guān)疾病診斷和治療反饋效果的重要指標(biāo)。

現(xiàn)有的基于液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的檢測(cè)方法大多數(shù)為實(shí)驗(yàn)室自建方法，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化。由于不同的實(shí)驗(yàn)室采用的試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的處理方法不同，常導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)結(jié)果差異大，且在前處理上也會(huì)消耗大量的時(shí)間。因此，采用包含校準(zhǔn)品、提取試劑、質(zhì)控品等檢測(cè)所需試劑的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)是解決這一問題的重要途徑。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種血清中25-羥基維生素D液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，可提高檢測(cè)準(zhǔn)確度、精密度以及大大縮短前處理時(shí)間，并提高檢測(cè)通量。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

血清中25-羥基維生素D液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)取血清與內(nèi)標(biāo)工作液于樣品管中渦旋混勻；

(2)向混勻后的混合液中加入提取劑，渦旋混勻待凈化；

(3)待凈化的樣品在裝有填料的柱上上樣，待全部上樣浸潤(rùn)后靜置；

(4)用洗脫劑進(jìn)行洗脫；