[發明專利]一種基于二茂鐵作為電子供體的適配體生物傳感器制備方法及應用

有效

• 申請號: 201811239957.6
• 申請日: 2018-10-23
• 公開（公告）號: CN110514713B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 郭業民;符家韻;史孝杰;孫霞
• 申請（專利權）人: 山東理工大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

一種基于二茂鐵作為電子供體的適配體生物傳感器制備方法及應用，步驟如下：在活化羧基的氧化石墨烯溶液中加入殼聚糖溶液，然后將該混合溶液修飾在絲網印刷碳電極表面；適配體末端添加特定堿基對設計合成發卡結構，并在兩端分別修飾氨基和二茂鐵，通過酰胺鍵的形成將該適配體鏈有效固定在氧化石墨烯?殼聚糖/絲網印刷碳電極表面；適配體與目標物的特異性識別誘導適配體構象改變，從而導致二茂鐵在磷酸鹽緩沖溶液中產生的電流信號發生變化，進而對目標物進行監測。本發明能實現丙溴磷、甲拌磷、水胺硫磷、氧樂果四種有機磷農藥的超靈敏檢測，檢測時間短，檢測限低，為有機磷農藥以及其他領域有害物質的檢測提供了一種新技術。

技術領域

本發明涉及一種基于二茂鐵作為電子供體的適配體生物傳感器制備方法及應用，屬于電化學生物傳感器檢測技術領域。

背景技術

有機磷農藥是一種含磷有機化合物，因其高效、低毒、低殘留的優點，在農業上被廣泛用于防治病蟲害和雜草。這些農藥的使用可以幫助防止農作物損失。但農產品上殘留的過量的有機磷農藥可通過食物鏈進入人體，與乙酰膽堿酯酶結合造成神經功能紊亂，導致癱瘓甚至死亡，對人類健康造成極大危害。丙溴磷、甲拌磷、水胺硫磷和氧樂果是被廣泛使用的有機磷農藥，在蔬菜產品中經常發生其超標事件。因此，構建一種快速、靈敏、安全可靠的農藥殘留檢測分析方法是十分必要的。

在過去的幾十年中，已經建立了各種有效的有機磷農藥殘留檢測方法，例如，氣相色譜法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附法、比色法、熒光法等。但它們大多耗時費力、儀器設備昂貴，操作人員技術要求高，不適用于現場快速分析。為了改善這些問題，電化學適配體傳感器由于其良好的選擇性、高的靈敏度和價格低廉等優點而得到廣泛應用。在電化學適配體傳感器的應用過程中，電化學信號的產生與放大是制約傳感器靈敏度等性能的關鍵因素。

氧化石墨烯是眾所周知的優異導電納米材料，它與殼聚糖溶液的結合在放大電化學信號的同時也為生物識別分子提供良好的生物相容性和穩定性。二茂鐵是一種有機過渡金屬化合物，由于其優良的可逆氧化還原性能和良好的化學穩定性而被廣泛用作電化學信號探針。近年來，有文獻報道它在磷酸鹽緩沖液中可提供電子，由此產生的電化學信號具有超高靈敏性。因此，利用上述材料有望開發一種超靈敏的電化學適配體傳感器并用于有機磷農藥檢測。

發明內容

本發明的目的在于提供一種靈敏度高、操作簡單、選擇性好的適配體生物傳感器，并用于丙溴磷、甲拌磷、水胺硫磷、氧樂果四種有機磷農藥的檢測。

本發明的技術方案為：在表面修飾有氧化石墨烯-殼聚糖復合薄膜的絲網印刷碳電極表面固定二茂鐵標記的發卡適配體，構成適配體生物傳感器；包括電極的預處理、氧化石墨烯-殼聚糖溶液的制備、適配體發卡結構的設計與標記、有機磷農藥的檢測，具體步驟為：

（1）電極的預處理：將絲網印刷碳電極工作區域完全浸入0.5 M硫酸溶液中，在-1.0～+1.0 V電勢范圍內進行5圈循環伏安掃描，以得到性能穩定電極；

（2）氧化石墨烯-殼聚糖溶液的制備：氧化石墨烯溶液中加入EDC和NHS，室溫條件下孵育活化氧化石墨烯上的羧基，離心清洗后加入殼聚糖溶液，制備1 mg/mL氧化石墨烯-殼聚糖溶液；

（3）適配體發卡結構的設計與標記：在適配體（5′-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3′）的3′端添加與5′端前幾個堿基對（AGCTTG）互補配對的堿基對CAAGCT，并在兩端分別標記氨基（-NH₂）和二茂鐵（Fc），新合成的適配體鏈（NH₂-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGC TCAAGCT-Fc）能夠有效形成發卡結構；