[發(fā)明專利]一種木麻黃內(nèi)生真菌抗細(xì)菌和/或抗氧化活性次生代謝產(chǎn)物的制備方法和用途

在審

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• 申請日: 2018-10-23
• 公開（公告）號: CN109280676A
• 公開（公告）日: 2019-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 單體江;王軍;毛子翎;王勝坤;伍慧雄;謝銀燕;吳春銀
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12P1/02
• 分類號: C12P1/02;A01N63/04;A01P1/00;C12R1/645
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

本發(fā)明公開了一種木麻黃內(nèi)生真菌抗細(xì)菌和/或抗氧化活性次生代謝產(chǎn)物的制備方法和用途，該方法包含：(1)采用組織塊分離法從木麻黃中分離內(nèi)生真菌；(2)將分離的內(nèi)生真菌采用大米固體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵；(3)待發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵產(chǎn)物用乙酸乙酯和丙酮的混合液冷浸提取，將提取液減壓濃縮得到木麻黃內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物；(4)采用薄層層析?生物自顯影法篩選具有抗細(xì)菌和/或抗氧化活性的次生代謝產(chǎn)物。本發(fā)明的方法能夠從木麻黃內(nèi)生真菌中獲得具有細(xì)菌和/或抗氧化活性的次生代謝產(chǎn)物，并獲得具有抗木麻黃青枯病菌的次生代謝產(chǎn)物，以用于木麻黃青枯病的防治。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物，具體涉及一種木麻黃內(nèi)生真菌抗細(xì)菌和/或抗氧化活性次生代謝產(chǎn)物的制備方法和用途。

背景技術(shù)

木麻黃(Casuarina spp.)，屬木麻黃科(Casuarinaceae)木麻黃屬(Casuarina)，常綠喬木或灌木，原產(chǎn)于澳大利亞、太平洋諸島以及亞洲東南部。木麻黃由于生長迅速、耐干旱、防風(fēng)固沙、耐鹽堿和生物固氮等特殊功能，廣泛用于熱帶和亞熱帶地區(qū)沿海防護(hù)林的建設(shè)，是我國東南沿海和華南地區(qū)不可替代的防護(hù)林樹種，同時也是重要的經(jīng)濟(jì)林和園林綠化樹種。

近年來，由于沿海木麻黃樹種單一，缺少抗病品種以及自然災(zāi)害等因素的影響，木麻黃青枯病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重制約沿海木麻黃防護(hù)林的發(fā)展，對我國東南沿海的生態(tài)環(huán)境和生態(tài)安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。木麻黃青枯病是危害木麻黃最嚴(yán)重的一種細(xì)菌性土傳病害，作為木麻黃的“癌癥”，目前尚無有效的防治方法，而且無對木麻黃內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種木麻黃內(nèi)生真菌抗細(xì)菌和/或抗氧化活性次生代謝產(chǎn)物的制備方法和用途，該方法和用途解決了目前尚無對木麻黃內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的研究以及對木麻黃青枯病的防治的問題，能夠從木麻黃內(nèi)生真菌中獲得具有抗細(xì)菌和/或抗氧化活性的次生代謝產(chǎn)物，并獲得具有抗木麻黃青枯病菌的次生代謝產(chǎn)物，以用于木麻黃青枯病的防治。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種木麻黃內(nèi)生真菌抗細(xì)菌和/或抗氧化次生代謝產(chǎn)物的制備方法，該方法包含：

(1)采用組織塊分離法從木麻黃中分離內(nèi)生真菌；

(2)將分離的內(nèi)生真菌采用大米固體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵；

(3)待發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵產(chǎn)物用乙酸乙酯和丙酮的混合液冷浸提取，將提取液減壓濃縮得到木麻黃內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物；

(4)采用薄層層析-生物自顯影法從中篩選具有抗細(xì)菌和/或抗氧化活性的次生代謝產(chǎn)物。

其中，具有抗細(xì)菌活性次生代謝產(chǎn)物的內(nèi)生真菌菌株包含：Pseudofusicoccumardesiacum、Botryosphaeria sp.。

其中，具有抗氧化活性次生代謝產(chǎn)物的內(nèi)生真菌菌株包含：Botryosphaeria sp.。

優(yōu)選地，在步驟(1)中，洗凈木麻黃枝條和果實，用70％乙醇處理，用0.2％氯化汞處理，用無菌水沖洗，置于無菌濾紙上晾干；去除表皮，將枝條分成大小一致的塊段，放在PDA培養(yǎng)基平板上，在28℃恒溫黑暗培養(yǎng)，待內(nèi)生真菌長出后，從每個菌落的邊緣挑取一小段菌絲接種到PDA培養(yǎng)基上，連續(xù)純化多次，至菌落形態(tài)一致。

優(yōu)選地，所述PDA培養(yǎng)基平板上含500μg/mL的硫酸鏈霉素。

優(yōu)選地，所述70％乙醇處理30s，所述0.2％氯化汞處理20min。

優(yōu)選地，在步驟(1)中，所述鑒定采用ITS序列測定方法，將測得的內(nèi)生真菌的rDNA-ITS序列與現(xiàn)有內(nèi)生真菌對比，以確定內(nèi)生真菌的種類。

優(yōu)選地，在步驟(2)中，采用大米固體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時間為60d。