[發明專利]一種木麻黃內生真菌抗細菌和/或抗氧化活性次生代謝產物的制備方法和用途

在審

• 申請號: 201811237375.4
• 申請日: 2018-10-23
• 公開（公告）號: CN109280676A
• 公開（公告）日: 2019-01-29
• 發明（設計）人: 單體江;王軍;毛子翎;王勝坤;伍慧雄;謝銀燕;吳春銀
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12P1/02
• 分類號: C12P1/02;A01N63/04;A01P1/00;C12R1/645
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種木麻黃內生真菌抗細菌和/或抗氧化次生代謝產物的制備方法，其特征在于，該方法包含：

(1)采用組織塊分離法從木麻黃中分離內生真菌；

(2)將分離的內生真菌采用大米固體培養基中進行發酵；

(3)待發酵結束，發酵產物用乙酸乙酯和丙酮的混合液冷浸提取，將提取液減壓濃縮得到木麻黃內生真菌次生代謝產物；

(4)采用薄層層析-生物自顯影法從中篩選具有抗細菌和/或抗氧化活性的次生代謝產物；

其中，具有抗細菌活性次生代謝產物的內生真菌菌株包含：Pseudofusicoccumardesiacum、Botryosphaeria sp.；

其中，具有抗氧化活性次生代謝產物的內生真菌菌株包含：Botryosphaeria sp.。

2.根據權利要求1所述的木麻黃內生真菌抗細菌和/或抗氧化活性次生代謝產物的制備方法，其特征在于，在步驟(1)中，洗凈木麻黃枝條和果實，用70％乙醇處理，用0.2％氯化汞處理，用無菌水沖洗，置于無菌濾紙上晾干；去除表皮，將枝條分成大小一致的塊段，放在PDA培養基平板上，在28℃恒溫黑暗培養，待內生真菌長出后，從每個菌落的邊緣挑取一小段菌絲接種到PDA培養基上，連續純化多次，至菌落形態一致。

3.根據權利要求2所述的木麻黃內生真菌抗細菌和/或抗氧化活性次生代謝產物的制備方法，其特征在于，所述PDA培養基平板上含500μg/mL的硫酸鏈霉素。

4.根據權利要求2所述的木麻黃內生真菌抗細菌和/或抗氧化活性次生代謝產物的制備方法，其特征在于，所述70％乙醇處理30s，所述0.2％氯化汞處理20min。

5.根據權利要求1所述的木麻黃內生真菌抗細菌和/或抗氧化活性次生代謝產物的制備方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述鑒定采用ITS序列測定方法，將測得的內生真菌的rDNA-ITS序列與現有內生真菌對比，以確定內生真菌的種類。

6.根據權利要求1所述的木麻黃內生真菌抗細菌和/或抗氧化活性次生代謝產物的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中，采用大米固體培養基進行發酵，發酵溫度為28℃，發酵時間為60d。

7.根據權利要求1所述的木麻黃內生真菌抗細菌和/或抗氧化活性次生代謝產物的制備方法，其特征在于，在步驟(3)中，采用乙酸乙酯和丙酮的混合液進行冷浸提取，冷浸時間為7d。

8.一種木麻黃內生真菌抗細菌和/或抗氧化活性次生代謝產物的用途，其特征在于，木麻黃內生真菌的次生代謝產物具有抗細菌和/或抗氧化活性，用于抗細菌和/或清除自由基；

其中，具有抗細菌活性次生代謝產物的內生真菌菌株包含：Pseudofusicoccumardesiacum、Botryosphaeria sp.；

具有抗氧化活性次生代謝產物的內生真菌菌株包含：Botryosphaeria sp.。

9.根據權利要求8所述的木麻黃內生真菌抗細菌和/或抗氧化活性次生代謝產物的用途，其特征在于，所述Pseudofusicoccum ardesiacum、Botryosphaeria sp.對根癌土壤桿菌、大腸桿菌、青枯病菌、黃瓜角斑病菌、番茄瘡痂病菌、枯草芽孢桿菌和溶血葡萄球菌均表現出抑制作用；所述Botryosphaeria sp.能夠作為抗木麻黃青枯病的生防菌。

10.根據權利要求8所述的木麻黃內生真菌抗細菌和/或抗氧化活性次生代謝產物的用途，其特征在于，所述Botryosphaeria sp.抗氧化活性的IC₅₀值小于1mg/mL。