[發明專利]一種生產羥基酪醇的方法

在審

• 申請號: 201811234787.2
• 申請日: 2018-10-23
• 公開（公告）號: CN109295113A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 蔡宇杰;劉金彬;李朝智;丁彥蕊;白亞軍;鄭曉暉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P7/22
• 分類號: C12P7/22;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種基因工程菌，屬于生物工程技術領域。本發明的基因工程菌導入了L?α?氨基酸轉氨酶、L?谷氨酸基因、α?酮酸脫羧酶基因、醇脫氫酶基因的酶基因，可應用于生物合成羥基酪醇。本發明還公開了重組大腸桿菌基因工程菌的構建方法和應用，進一步地，通過敲除或強化表達大腸桿菌基因組上的相將關基因促進底物的轉運及減少產物的分解，提高了重組菌的生產效率。利用本發明的重組菌轉化生產羥基酪醇的方法，具有操作簡單，成本低，產物合成效率高的特點，具有良好的產業化前景。

技術領域

本發明涉及一種生產羥基酪醇的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

羥基酪醇(3,4-二羥基苯乙醇，Hydroxytyrosol，3,4-Dihydroxyphenylethanol，2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethanol)，是一種天然的多酚類化合物，具有很強的抗氧化活性，主要以酯類的形式存在于橄欖的果實和枝葉中。羥基酪醇苯環上連接有兩個羥基，是其主要的抗氧化活性基團，因其固有的抗氧化活性可預防多種疾病的發生。除此之外，羥基酪醇還可消除體內自由基，恢復人體臟腑器官的健康狀態，防止腦衰，延緩衰老。

近幾年的研究表明，羥基酪醇對多種疾病有明顯的作用，羥基酪醇在糖脂代謝調節、防治腫瘤、抗血栓、緩解動脈硬化、抑制病原微生物、防治視網膜黃斑變性、保護軟骨和防治骨質疏松等方面都具有良好的生物活性。隨著人們對羥基酪醇生物學活性及體內代謝特征的不斷研究，越來越多的生物活性被開發出來，這些研究也受到國內外研究者的廣泛關注。

目前羥基酪醇的工業化生產還不成熟，且大都處于實驗室階段。其小量制備主要有以下兩種方式：1)通過酸解或酶解橄欖廠的廢水、橄欖葉、原生橄欖油中的橄欖苦苷，再進一步獲得羥基酪醇；2)利用化學合成的方法制備羥基酪醇。利用生產橄欖油產生的廢水制備羥基酪醇，既能進行廢物利用，又能減少對環境的污染。但是此方法需要大量的溶劑，并且羥基酪醇的回收率不高。通過化學合成的方法雖然能成功合成羥基酪醇(CN201110357075.1、CN201210342015.7)，但由于原料和試劑成本昂貴，反應過程中產生許多副產物，并且合成步驟較長，反應劇烈不易控制等缺點，使得化學合成方法不適合工業化生產。除此之外，由于羥基酪醇是重要的食品、藥物、保健品的原材料，因此通過化學方法得到的產品不受人們歡迎。目前市場上的這一類物質主要從植物中提到得到，例如，中國發明專利CN201610883391.5公開了一種橄欖葉羥基酪醇的提取工藝；中國發明專利CN201710195462.7從橄欖葉中提取羥基酪醇的方法。由于植物資源及其含量的限制，并且提取過程繁瑣、復雜，使得這些產品價格昂貴，因此通過微生物法生產受到了廣泛的關注。

2012年，Yasuharu Satoh等人提出以酪氨酸為底物，在酪氨酸羥化酶的作用下生成L-多巴，L-多巴在L-多巴脫羧酶作用下生成多巴胺，接著在酪胺氧化酶作用下生成3,4-二羥基苯乙醛，再在醇脫氫酶作用下生成羥基酪醇，(Engineering of l-tyrosineoxidation in Escherichia coli and microbial production of hydroxytyrosol,Metab.Eng.14(6)603-610(2012))。通過構建含有不同基因的大腸宿主得到一株菌，分別以1mM酪氨酸為底物生成0.19±0.0056mM羥基酪醇，以1mM L-多巴生成0.74±0.088mM羥基酪醇。國際發明專利WO2017US39329(HOST CELLS AND METHODS FOR PRODUCINGHYDROXYTYROSOL)也公開了兩株宿主細胞共同培養發酵酪氨酸產羥基酪醇的方法，首先在第一個宿主細胞的作用下產生L-多巴，進一步在產生羥基酪醇。這一種制備羥基酪醇的方法大多采用來源于人或小鼠的基因，致使基因在大腸宿主或其他異源宿主中的表達不兼容。