[發明專利]一種三七不定根的誘導方法

在審

• 申請號: 201811234688.4
• 申請日: 2018-10-23
• 公開（公告）號: CN109329056A
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發明（設計）人: 張宗申;劉志琨;鐘滿;趙悅
• 申請（專利權）人: 大連工業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 大連格智知識產權代理有限公司 21238
• 代理人: 劉琦

1.一種三七不定根的誘導方法，其特征在于，包括以下步驟:

S1、組合培養基的配制：

S11、濾紙片剪裁：取定性濾紙將其裁剪成與無菌組培瓶底部形狀一致的圓形，滅菌備用；

S12、MS培養基的配制：取MS固體粉末溶于水，添加蔗糖和瓊脂，調節pH＝5.8～6.0，121℃、0.1MPa高溫滅菌25min后保溫防止凝固，配制成蔗糖濃度為30～50g/L，瓊脂含量為8g/L的MS固瓊脂養基；

S13、上層愈傷組織誘導濾紙的制備：取0.5～1.0mg/L 2,4-D除菌，將4片步驟S11所得濾紙片疊放在一起，在2,4-D中浸泡20s，得上層愈傷組織誘導濾紙層；

S14、中層不定根誘導濾紙層的制備：取植物激素除菌后混勻，得混合植物激素1，所述混合植物激素1中含有1.0～2.0mg/L IBA、1.0～2.0mg/L 2,4-D、0.5～1.0mg/L 6-BA和0.2～0.5mg/L NAA；將4片步驟S11所得濾紙片疊放在一起，置于所述混合植物激素1中浸泡20s，得中層不定根誘導濾紙層；

S15、底層不定根誘導濾紙層的制備：取植物激素除菌后混勻，得混合植物激素2，所述混合植物激素2中含有2.5～5.0mg/L IBA、0.2～1.0mg/L NAA、0.2～0.6mg/L 6～BA、0.5～1.0mg/L KT和50μmol/L茉莉酸甲酯；將4片步驟S11所得濾紙片疊放在一起，在混合植物激素2中浸泡20s，得底層不定根誘導濾紙層；

S16、組合培養基的制備：將步驟S15所得底層不定根誘導濾紙層平鋪于無菌組培瓶底，倒入步驟S12制備的MS瓊脂培養基，凝固后形成厚度為1.0cm的底層MS層；將步驟S14所得中層不定根誘導濾紙層平鋪于底層MS層上，倒入步驟S12制備的MS瓊脂培養基，凝固后形成厚度為0.5cm的中層MS；將步驟S13制備的上層愈傷組織誘導濾紙層平鋪于中層MS上，得組合培養基；所述組合培養基從下至上依次為底層不定根誘導濾紙層、底層MS層、中層不定根誘導濾紙層、中層MS層、上層愈傷組織誘導濾紙層；

S2、三七愈傷組織的誘導：取無菌三七根、幼嫩莖段2cm左右或幼嫩葉片置于步驟S1制備的組合培養基的上層愈傷組織誘導濾紙層上，24～28℃下黑暗無菌培養10～15d，獲得三七愈傷組織；

S3、三七不定根的誘導：向步驟S1制備的組合培養基中加入無菌MS液體培養基，液體沒過培養基上層濾紙層1mm，在24～28℃及黑暗條件下無菌培養15～20d，得到帶有愈傷組織的三七不定根。

2.一種用于權利要求1所述三七不定根誘導的組合培養基，其特征在于，所述培養基由下至上依次為底層不定根誘導濾紙層、底層MS層、中層不定根誘導濾紙層、中層MS層和上層愈傷組織誘導濾紙層；

其中，底層不定根誘導濾紙層由4片含有2.5～5.0mg/L IBA、0.2～1.0mg/L NAA、0.2～0.6mg/L 6～BA、0.5～1.0mg/L KT、50μmol/L茉莉酸甲酯的濾紙疊放而成；中層不定根誘導濾紙層由4片含有1.0～2.0mg/L IBA、1.0～2.0mg/L 2,4-D、0.5～1.0mg/L 6-BA和0.2～0.5mg/L NAA的濾紙疊放而成；上層愈傷組織誘導濾紙層由4片含有0.5～1.0mg/L 2,4-D的濾紙疊放而成；底層MS層為厚度1.0cm的蔗糖的濃度為30～50g/L，瓊脂含量為8g/L的MS固體瓊脂養基；中層MS層為厚度0.5cm的蔗糖的濃度為30～50g/L、瓊脂含量為8g/L的MS固體瓊脂養基。

3.根據權利要求2所述用于三七不定根誘導的組合培養基的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、濾紙片剪裁：取定性濾紙將其裁剪成與無菌組培瓶底部大小一致的圓形紙片，滅菌備用；

S2、取MS固體粉末溶于水，添加蔗糖和瓊脂，調節pH＝5.8～6.0，121℃、0.1MPa高溫滅菌25min后保溫防止凝固，配制成蔗糖的濃度為30～50g/L、瓊脂含量為8g/L的MS固體瓊脂養基；

S3、上層愈傷組織誘導濾紙的制備：取0.5～1.0mg/L 2,4-D除菌，將4片步驟S11所得滅菌后的濾紙片疊放在一起，在2,4-D中浸泡20s，得上層愈傷組織誘導濾紙層；

S4、中層不定根誘導濾紙層的制備：取植物激素除菌后混勻，得混合植物激素1，所述混合植物激素1中含有1.0～2.0mg/L IBA、1.0～2.0mg/L 2,4-D、0.5～1.0mg/L 6-BA和0.2～0.5mg/L NAA，將4片步驟S1所得滅菌后的濾紙片疊放在一起，置于所述混合植物激素1中浸泡20s，得中層不定根誘導濾紙層；

S5、底層不定根誘導濾紙層的制備：取植物激素除菌后混勻，得混合植物激素2，所述混合植物激素2中含有2.5～5.0mg/L IBA、0.2～1.0mg/L NAA、0.2～0.6mg/L 6～BA、0.5～1.0mg/L KT和50μmol/L茉莉酸甲酯，將4片步驟S1所得滅菌后的濾紙片疊放在一起，在混合植物激素2中浸泡20s，得底層不定根誘導濾紙層；

S6、組合培養基的制備：將步驟S5所得底層不定根誘導濾紙層平鋪于無菌組培瓶底，倒入步驟S2制備的MS瓊脂培養基，凝固后形成厚度為1.0cm的底層MS層；將步驟S4所得中層不定根誘導濾紙層平鋪于底層MS層上，倒入步驟S2制備的MS瓊脂培養基，凝固后形成厚度為0.5cm的中層MS；將步驟S3制備的上層愈傷組織誘導濾紙層平鋪于中層MS上，得組合培養基；所述組合培養基從下至上依次為底層不定根誘導濾紙層、底層MS層、中層不定根誘導濾紙層、中層MS層、上層愈傷組織誘導濾紙層。