[發(fā)明專利]檢測(cè)蓮草直胸跳甲JHE基因轉(zhuǎn)錄水平的引物及方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811232458.4
• 申請(qǐng)日: 2018-10-22
• 公開（公告）號(hào): CN109161602B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭麗禎;傅建煒;何肖云;李建宇;史夢(mèng)竹;林凌鴻;王秋月
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

1.一種檢測(cè)蓮草直胸跳甲JHE基因轉(zhuǎn)錄水平的熒光定量PCR引物，其特征在于：包括符合熒光定量PCR反應(yīng)特點(diǎn)的上下游引物：

JHE-F：5`-GCCTATGGTAACTGGTCACAA-3`，

JHE-R：5`-GCGTTGGATTTCTGTATTTAGCA-3`。

2.一種采用權(quán)利要求1所述引物檢測(cè)蓮草直胸跳甲JHE基因轉(zhuǎn)錄水平的熒光定量PCR方法，其特征在于：按如下步驟：

（1）cDNA第一鏈合成：提取樣本的總RNA并純化，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到以提取的RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA；

（2）以下述引物進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)

該基因的熒光定量上下游引物：

JHE-F：5`-GCCTATGGTAACTGGTCACAA-3`，

JHE-R：5`-GCGTTGGATTTCTGTATTTAGCA-3`；

以及作為內(nèi)參基因的上下游引物：

Tubulin-F: 5`-AGATGTCCGCCACCTTCA-3`，

Tubulin-R: 5`-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTCA-3`；

常規(guī)PCR擴(kuò)增體系為25μL：10×buffer 2.5μL ，dNTP 1.0μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，100ng/μL cDNA模板1.0μL，Ex-TaqE 0.15μL，水19.35μL；

常規(guī)PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s， 56℃退火30 s， 72℃延伸1 min，此條件下35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10min；

（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：

以步驟（1）得到的cDNA為模板，加入步驟（2）所述的引物，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，擴(kuò)增后取平均值；

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系為：SYBR^? Premix Ex Taq^TM12.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，100ng/μL cDNA 1.0μL，補(bǔ)足水至25μL；

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 30 s，然后95℃變性5 s 、60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。