[發(fā)明專利]高純度紫杉醇的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811230781.8
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN109232481A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 覃家日
• 申請（專利權(quán)）人: 覃家日
• 主分類號: C07D305/14
• 分類號: C07D305/14
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11369
• 代理人: 靳浩

本發(fā)明提供一種高純度紫杉醇的制備方法，包括以下步驟：1)建立穩(wěn)定的紅豆杉形成層干細(xì)胞培養(yǎng)體系；2)往懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加紅豆杉內(nèi)生真菌提取液，接種紅豆杉細(xì)胞，人工光照條件下進(jìn)行通氣培養(yǎng)6?8天，向液體懸浮培養(yǎng)基中加入茉莉酸甲酯和憂遁草提取物繼續(xù)培養(yǎng)；3)收集紅豆杉細(xì)胞，進(jìn)行紫杉醇的粗提取；4)對粗提取物進(jìn)行純化；5)將上述濃縮液II通過C18高效液相色譜純化柱，然后用甲醇進(jìn)行洗脫，收集并合并紫杉醇洗脫部分，減壓蒸發(fā)溶劑甲醇以使紫杉醇結(jié)晶釋出，離心收集晶體，將晶體進(jìn)行真空冷凍干燥，獲得高純度紫杉醇濃縮液II。本發(fā)明具有誘導(dǎo)成功率高、紫杉醇提取純度高等特點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及藥用植物的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種高純度紫杉醇的制備方法。

背景技術(shù)

紅豆杉是紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus)的一類喬木和灌木，全世界共11種。紅豆杉具有較廣的分布范圍，從歐亞大陸和北美的亞北極區(qū)到中美和東南亞的亞熱帶甚至熱帶地區(qū)均有分布。研究表明，紅豆杉中的紫杉醇對治療卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、黑色素瘤、白血病等多種癌癥有特效，致使紫杉醇成為當(dāng)前最熱門的抗癌藥物之一。然而，現(xiàn)有技術(shù)中，紫杉醇來源與從紅豆杉的樹皮中獲取，含量非常低，提取困難，提取純度低，根本無法滿足人們對對高純度紫杉醇日益增長的需求。因此，提高紫杉醇的純度具有重要意義。。

發(fā)明內(nèi)容

作為各種廣泛且細(xì)致的研究和實驗的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)階段添加紅豆杉內(nèi)生真菌提取液能提高單位細(xì)胞中紫杉醇的含量。基于這種發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。

本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種高純度紫杉醇的制備方法，其能夠提高單位細(xì)胞中紫杉醇的含量，防止紅豆杉細(xì)胞在培養(yǎng)過程中發(fā)生變異。

為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種高純度紫杉醇的制備方法，其包括以下步驟：

1)選用紅豆杉的嫩莖上的芽體作為培養(yǎng)材料，經(jīng)洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75％酒精中處理10-30秒，然后再經(jīng)0.1％的升汞消毒后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分，然后進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，選取連續(xù)繼代3～5次且生長旺盛、質(zhì)地疏松、狀態(tài)穩(wěn)定均一的新鮮胚性愈傷組織接種到液體懸浮培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)，每7-8天繼代一次，經(jīng)2-3個月的繼代培養(yǎng)建立穩(wěn)定生長的紅豆杉形成層干細(xì)胞培養(yǎng)體系；

2)往懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加紅豆杉內(nèi)生真菌提取液，混合均勻，獲得混合培養(yǎng)液，將混合培養(yǎng)液置于生物反應(yīng)器中，選取生長速率達(dá)9.0～12.0mg/g·d的紅豆杉形成層干細(xì)胞培養(yǎng)體系，按接種量不小于10％的接種量接種到生物反應(yīng)器中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24℃-26℃，人工光照條件下進(jìn)行通氣培養(yǎng)6-8天，向液體懸浮培養(yǎng)基中加入茉莉酸甲酯和憂遁草提取物繼續(xù)培養(yǎng)以誘導(dǎo)紅豆杉形成層細(xì)胞累積產(chǎn)生紫杉醇；

3)收集經(jīng)步驟2)懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)物，使用磷酸緩沖溶液進(jìn)行洗滌3-5次后進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干粉，往所述凍干粉末中添加去離子水，水浴加熱浸泡所述凍干粉，離心過濾，濾渣加水反復(fù)浸泡2-3次，合并濾液，用乙酸乙酯進(jìn)行攪拌萃取，靜置，待分層后收集水相，水相重復(fù)用乙酸乙酯萃取2-3次，收集水相，添加乙醇溶液低溫減壓濃縮得浸膏I；

4)將所述浸膏I用適量無水乙醇溶解后，形成粗提液，加入與無水乙醇相同體積的丙酮，靜置沉降10-11h，過濾，在濾液中添加活性炭顆粒，置于43-46℃的條件下進(jìn)行脫色處理，過濾，往濾液中添加大孔樹脂吸附，然后用不同濃度的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，合并洗脫液后低溫減壓濃縮得濃縮液II；

5)將上述濃縮液II通過C18高效液相色譜純化柱，然后用甲醇進(jìn)行洗脫，收集并合并紫杉醇洗脫部分，減壓蒸發(fā)溶劑甲醇以使紫杉醇結(jié)晶釋出，離心收集晶體，將晶體進(jìn)行真空冷凍干燥，獲得高純度紫杉醇濃縮液II。