[發明專利]高純度紫杉醇的制備方法

在審

• 申請號: 201811230781.8
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN109232481A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發明（設計）人: 覃家日
• 申請（專利權）人: 覃家日
• 主分類號: C07D305/14
• 分類號: C07D305/14
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 靳浩

1.一種高純度紫杉醇的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)選用紅豆杉的嫩莖上的芽體作為培養材料，經洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75％酒精中處理10-30秒，然后再經0.1％的升汞消毒后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分，然后進行誘導培養，選取連續繼代3～5次且生長旺盛、質地疏松、狀態穩定均一的新鮮胚性愈傷組織接種到液體懸浮培養基中，震蕩培養，每7-8天繼代一次，經2-3個月的繼代培養建立穩定生長的紅豆杉形成層干細胞培養體系；

2)往懸浮培養的培養基中添加紅豆杉內生真菌提取液，混合均勻，獲得混合培養液，將混合培養液置于生物反應器中，選取生長速率達9.0～12.0mg/g·d的紅豆杉形成層干細胞培養體系，按接種量不小于10％的接種量接種到生物反應器中進行懸浮培養，培養溫度為24℃-26℃，人工光照條件下進行通氣培養6-8天，向液體懸浮培養基中加入茉莉酸甲酯和憂遁草提取物繼續培養以誘導紅豆杉形成層細胞累積產生紫杉醇；

3)收集經步驟2)懸浮培養的培養物，使用磷酸緩沖溶液進行洗滌3-5次后進行冷凍干燥，得到凍干粉，往所述凍干粉末中添加去離子水，水浴加熱浸泡所述凍干粉，離心過濾，濾渣加水反復浸泡2-3次，合并濾液，用乙酸乙酯進行攪拌萃取，靜置，待分層后收集水相，水相重復用乙酸乙酯萃取2-3次，收集水相，添加乙醇溶液低溫減壓濃縮得浸膏I；

4)將所述浸膏I用適量無水乙醇溶解后，形成粗提液，加入與無水乙醇相同體積的丙酮，靜置沉降10-11h，過濾，在濾液中添加活性炭顆粒，置于43-46℃的條件下進行脫色處理，過濾，往濾液中添加大孔樹脂吸附，然后用不同濃度的乙醇進行梯度洗脫，合并洗脫液后低溫減壓濃縮得濃縮液II；

5)將上述濃縮液II通過C18高效液相色譜純化柱，然后用甲醇進行洗脫，收集并合并紫杉醇洗脫部分，減壓蒸發溶劑甲醇以使紫杉醇結晶釋出，離心收集晶體，將晶體進行真空冷凍干燥，獲得高純度紫杉醇濃縮液II。

2.根據權利要求1所述的高純度紫杉醇的制備方法，其特征在于，在培養皿內設置發芽床，所述發芽床從上到下第一層為濾紙第二層為海綿，所述海綿的高度為2-4毫米，將所述培養皿高壓蒸汽滅菌，冷切后添加液體誘導培養基，在所述濾紙層上添加消毒后的培養材料，控制培養條件，進行誘導培養，獲得愈傷組織。

3.根據權利要求2所述的高純度紫杉醇的制備方法，其特征在于，所述培養條件為：溫度23-25℃，采用藍光LED燈和紅光LED燈進行交替照射，藍光LED燈照射3-5小時，光照強度為1500-1800lux；紅光LED燈照射1-2小時，光照強度為2200-2500Lux。

4.根據權利要求2所述的高純度紫杉醇的制備方法，其特征在于，所述誘導培養基為在每升MS培養基中添加α-萘乙酸0.8-1.2mg，芐氨基腺嘌呤0.5-0.7mg，赤霉素0.2-0.3mg和槲皮素0.6-0.8mg。

5.根據權利要求1所述的高純度紫杉醇的制備方法，其特征在于，所述紅豆杉內生真菌提取液的制備方法為：將紅豆杉內生真菌接種到PDA液體發酵培養基中，在溫度為27-29℃，轉速為80-100r/min的搖床中振擋培養4-6天，培養結束后超聲波破碎5-8min，添加與培養基等體積的乙酸乙酯進行活性成分萃取，待溶液分層后去掉水層，獲得萃取液，減壓干燥所述萃取液，添加0.2-0.4倍萃取液體積的去離子水，獲得所述紅豆杉內生真菌提取液。

6.根據權利要求5所述的高純度紫杉醇的制備方法，其特征在于，往所述萃取液添加等體積的水，待溶液分層后去掉水層，進行重復萃取2-3遍。

7.根據權利要求1所述的高純度紫杉醇的制備方法，其特征在于，所述紅豆杉內生真菌提取液添加量為懸浮培養的培養基質量的5-10％。

8.根據權利要求1所述的高純度紫杉醇的制備方法，其特征在于，所述憂遁草提取物的制備方法為：將憂遁草原料烘干粉碎過100-200目篩，獲得篩下粉末，往篩下粉末中添加無水乙醇，在4-8℃的條件下保存24-28h，過濾，獲得濾液，減壓蒸餾所述濾液獲得獲得乙醇提物粗浸膏，往所述乙醇提物粗浸膏中添加去離子水溶解，然后添加正丁醇萃取，將正丁醇萃取液減壓濃縮得浸膏，再次添加去離子水溶解，獲得憂遁草提取物。