[發(fā)明專利]一種iCAR-T細胞的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811229487.5
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN109234317A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發(fā)明（設計）人: 顧雨春;尹樂;吳理達;張會遠;譚聲江
• 申請（專利權）人: 北京呈諾醫(yī)學科技有限公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 李青

本發(fā)明涉及基因領域，特別涉及一種iCAR?T細胞的制備方法。一種iCAR?T細胞的制備方法，CAR?T的DNA序列插入到iPS細胞的AAVS1位點，得到的CAR?iPS細胞分化獲得iCAR?T細胞。本發(fā)明制備的iCAR?T細胞由CAR?iPS分化獲得，iPS細胞可增殖周期長，更便于進行基因修飾。相對于慢病毒感染獲得的iCAR?T細胞，CAR?iPS分化獲得的iCAR?T純度更高，可以接近于100％；基因插入位點均為AAVS1位點，插入位置明確，安全性更高；由于iPS可近乎無限增殖，因此由CAR?iPS獲得的iCAR?T也可近乎無限獲得，不受外周血分離影響。

技術領域

本發(fā)明涉及iCAR-T細胞制備領域，具體而言，涉及一種iCAR-T細胞的制備方法。

背景技術

目前，CAR-T的制備主要是通過慢病毒感染對原代T細胞進行基因修飾。

如申請?zhí)枮?01610744414.4涉及免疫學和分子生物學領域，特別涉及一種制備CAR-T細胞的方法以及制得的CAR-T細胞及其應用。一種制備CAR-T細胞的方法，是將包含CAR的病毒感染CD3陽性T細胞得到CAR-T細胞。

如申請?zhí)枮?01711479751.6公開了一種CAR-T細胞的制備方法、制得的CAR-T細胞及其應用，所述制備方法包括以下步驟：S1、T淋巴細胞的分離、激活和擴增：將分離的CD3+CD8+T淋巴細胞激活后培養(yǎng)擴增；S2、攜帶CAR的重組慢病毒感染所述步驟S1處理后的T淋巴細胞，制得所述CAR-T細胞，其中，所述攜帶CAR的重組慢病毒中攜帶的CAR基因包含CD28胞內區(qū)和4 1BB胞內區(qū)，所述CD28胞內區(qū)和4 1BB胞內區(qū)的核苷酸序列分別如SEQ ID7和SEQID9所示。本發(fā)明制備方法制得的CAR-T細胞可廣泛應用于多種癌癥的治療。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明方法制備的CAR-T細胞增殖率相比于常規(guī)方法得到了顯著提高。

如申請?zhí)枮?01710730561.0公開了一種CAR-T細胞的制備方法，用于全封閉的CAR-T細胞制備設備，其包括：1)將血液樣本和等體積的淋巴細胞分離液加入分離培養(yǎng)罐中進行離心分離以獲得單個核細胞；2)對上述單個核細胞進行分選以獲得T細胞；3)在分離培養(yǎng)罐中對T細胞進行誘導培養(yǎng)；4)將帶有目的基因的載體和經過誘導培養(yǎng)的T細胞按照預設比例混合后進行基因轉導；5)于分離培養(yǎng)罐內對經基因轉導的細胞進行擴增培養(yǎng)；6)獲得CAR-T細胞終產品，進行包裝。上述CAR-T細胞的制備方法中，利用分離培養(yǎng)罐制備CAR-T細胞，相比于現(xiàn)有技術中利用培養(yǎng)皿體外培養(yǎng)CAR-T細胞的方式，其步驟規(guī)范，更便于實現(xiàn)CAR-T細胞的大規(guī)模生產。

還有針對不同疾病制備的CAR-T細胞，如申請?zhí)枮?01710672564.3公開了一種針對小細胞肺癌的CAR-T細胞制備方法，該方法包括如下步驟：采集患者外周血并加入至Ficoll淋巴細胞分離液中；吸取離心液中兩液面交界處的細胞層至離心管中，加入生理鹽水洗滌，離心得到T細胞；T細胞體外擴增；將慢病毒對S4中的T細胞進行轉染并擴增培養(yǎng)，獲得CAR-T細胞；將CAR-T細胞與人血白蛋白，并加入生理鹽水，制備成小細胞肺癌細胞制劑。

由于慢病毒感染，修飾基因插入位點不明確，感染效率受限，且有潛在的致瘤風險。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內容

本發(fā)明的第一目的在于提供一種iCAR-T細胞的制備方法，涉及CRISPR/Cas9介導的基因修飾技術以及iPS細胞向T細胞定向分化技術，iCAR-T細胞由CAR-iPS分化獲得。相對于慢病毒感染獲得的CAR-T細胞，CAR-iPS分化獲得的iCAR-T純度更高，可以接近于100％；iPS誘導的T細胞，來源于同一株單克隆，DNA遺傳信息均一穩(wěn)定；基因插入位點均為AAVS1位點，插入位置明確，安全性更高；由于iPS可近乎無限增殖，因此，由CAR-iPS獲得的iCAR-T細胞也可近乎無限獲得，不受外周血分離影響。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：