[發明專利]一種iCAR-T細胞的制備方法在審
| 申請號： | 201811229487.5 | 申請日： | 2018-10-22 |
| 公開（公告）號： | CN109234317A | 公開（公告）日： | 2019-01-18 |
| 發明（設計）人： | 顧雨春;尹樂;吳理達;張會遠;譚聲江 | 申請（專利權）人： | 北京呈諾醫學科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/90 | 分類號： | C12N15/90;C12N9/22 |
| 代理公司： | 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371 | 代理人： | 李青 |
| 地址： | 100000 北京市經濟技術*** | 國省代碼： | 北京;11 |
| 權利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 制備 位點 分化 慢病毒感染 插入位置 基因插入 基因領域 基因修飾 無限增殖 增殖周期 外周血 細胞 | ||
1.一種iCAR-T細胞的制備方法，其特征在于，CAR-T的DNA序列插入到iPS細胞的AAVS1位點，得到的CAR-iPS細胞分化獲得iCAR-T細胞。
2.根據權利要求1所述的iCAR-T細胞的制備方法，其特征在于，制備步驟如下：
構建攜帶有AAVS1位點附近同源序列和CAR-T的DNA序列的donor載體；
構建B2M基因敲除位點對應的CRISPR/Cas9載體；
所述攜帶有AAVS1位點附近同源序列和CAR-T的DNA序列的donor載體、所述B2M基因敲除位點對應的CRISPR/Cas9載體轉入iPS細胞，篩選得到CAR-iPS細胞；
所述CAR-iPS細胞分化得到所述iCAR-T。
3.根據權利要求2所述的iCAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述AAVS1位點附近同源序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
4.根據權利要求2所述的iCAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述iPS細胞為B2M基因缺失的iPS細胞。
5.根據權利要求2所述的iCAR-T細胞的制備方法，其特征在于，構建的B2M基因敲除位點對應的CRISPR/Cas9載體通過轉染293T細胞驗證其對基因組DNA的內切活性。
6.根據權利要求2所述的iCAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述轉入為電轉。
7.根據權利要求6所述的iCAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述電轉的參數為：電壓1200V，時間間隔為18-25ms，電擊次數為2次以上。
8.根據權利要求7所述的iCAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述電擊時間間隔為20-22ms，電擊次數為2-3次。
9.根據權利要求2所述的iCAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述轉入后，使用puro篩選挑取單克隆，然后進行驗證。
10.根據權利要求9所述的iCAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述驗證采用PCR擴增驗證。
該專利技術資料僅供研究查看技術是否侵權等信息，商用須獲得專利權人授權。該專利全部權利屬于北京呈諾醫學科技有限公司，未經北京呈諾醫學科技有限公司許可，擅自商用是侵權行為。如果您想購買此專利、獲得商業授權和技術合作，請聯系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201811229487.5/1.html，轉載請聲明來源鉆瓜專利網。
