[發明專利]一種肝樣細胞成熟與擴增的方法

在審

• 申請號: 201811228877.0
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN111073843A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 周明
• 申請（專利權）人: 立沃生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0775;C12N5/074;C12N5/0735
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• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種肝樣細胞成熟與擴增的方法，步驟包括：步驟S1：干細胞在體外使用誘導液進行培養誘導間充質干細胞分化為肝樣細胞；步驟S2：將肝樣細胞通過脾臟定點注射到FAH基因缺陷大鼠肝臟載體；步驟S3：刺激FAH基因缺陷大鼠肝臟載體自體肝細胞凋亡，促進肝樣細胞成熟、增殖；步驟S4：分離與純化得到人原代肝細胞。本發明在體外誘導人間充質干細胞形成肝樣細胞，通過脾臟定點注射到FAH基因缺陷大鼠肝臟中，利用FAH基因缺陷大鼠肝臟內環境，使肝樣細胞高效地分化為成熟的人肝細胞并實現肝細胞的快速擴增。從而解決了肝細胞體外再生的方法得到的肝細胞不成熟、規模小、成本高等缺點。

【技術領域】

本發明涉及生物醫學技術領域，涉及細胞改造技術領域，尤其涉及肝樣細胞成熟與擴增的方法。

【背景技術】

人原代肝細胞是指從人肝組織取出后立即培養的肝細胞，可用于基礎生命科學研究、藥物研發、肝細胞移植以及肝臟器官3D打印，市場容量可達千億。然而，肝細胞來源問題一直制約其廣泛應用。一方面由于文化因素，我國的公民離世后的器官捐獻率極低；另一方面，我國關于器官捐獻的法規尚不完善，這都導致人原代肝細胞極為缺乏。

目前，解決人原代肝細胞來源問題的技術手段主要包括：1)肝細胞體外再生，即利用胚胎干細胞、誘導多能干細胞或者間充質干細胞在體外利用不同的誘導因子及誘導步驟分化成肝樣細胞；2)肝細胞體內擴增，即將人原代肝細胞接種到免疫缺陷、自體肝細胞誘導凋亡的小鼠模型中，長出人鼠嵌合肝。肝細胞體外再生的方法得到的肝細胞為肝樣細胞，表達部分肝細胞標志基因，僅具備肝細胞部分生理功能，與人原代肝細胞還有較大差距。另外，肝細胞體外再生的方法具有操作要求高、規模小、成本高等缺點，在實際應用中不具有可行性。肝細胞(小鼠)體內擴增的方法可得到一定數量的成熟人原代肝細胞，但無法實現個性化定制，且肝細胞數量有限。

【發明內容】

本發明要解決的技術問題是提供一種肝樣細胞成熟與擴增的方法。

本發明采用如下技術方案：

本發明提供了一種肝樣細胞成熟與擴增的方法，具體步驟包括：

步驟S1：干細胞在體外使用相應的誘導液進行培養誘導干細胞分化為肝樣細胞；

步驟S2：將肝樣細胞通過脾臟定點注射到FAH基因缺陷大鼠肝臟載體；

步驟S3：刺激FAH基因缺陷大鼠肝臟載體自體肝細胞凋亡，促進肝樣細胞成熟、增殖；

步驟S4：分離與純化得到人原代肝細胞。

進一步的，所述干細胞包括骨髓來源的間充質干細胞、胚胎干細胞或誘導多能干細胞。

進一步的，所述骨髓來源的間充質干細胞體外誘導間充質干細胞分化為肝樣細胞具體步驟為：在細胞融合度為85％時，加入肝細胞誘導液，每3天換1次液，誘導培養2周后，向肝細胞誘導液加入30ng/ml的humanOncostatinM，繼續誘導1周后經免疫熒光鑒定白蛋白表達；

肝細胞誘導液包括：IMDM培養液、100units/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素、25mMHepesBuffer Solution、1倍體積的ITS+1LiquidMedia Supplement、20μg/mldexamethasone 和20ng/mlHGF。