[發明專利]一種肝樣細胞成熟與擴增的方法

在審

• 申請號: 201811228877.0
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN111073843A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 周明
• 申請（專利權）人: 立沃生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0775;C12N5/074;C12N5/0735
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種肝樣細胞成熟與擴增的方法，其特征在于，具體步驟包括：

步驟S1：干細胞在體外使用相應的誘導液進行培養誘導干細胞分化為肝樣細胞；

步驟S2：將肝樣細胞通過脾臟定點注射到FAH基因缺陷大鼠肝臟載體；

步驟S3：刺激FAH基因缺陷大鼠肝臟載體自體肝細胞凋亡，促進肝樣細胞成熟、增殖；

步驟S4：分離與純化得到人原代肝細胞。

2.根據權利要求1所述肝樣細胞成熟與擴增的方法，其特征在于：所述干細胞包括骨髓來源的間充質干細胞、胚胎干細胞或誘導多能干細胞。

3.根據權利要求2所述肝樣細胞成熟與擴增的方法，其特征在于，所述骨髓來源的間充質干細胞體外誘導間充質干細胞分化為肝樣細胞具體步驟為：在細胞融合度為85％時，加入肝細胞誘導液，每3天換1次液，誘導培養2周后，向肝細胞誘導液加入30ng/ml的humanOncostatin M，繼續誘導1周后經免疫熒光鑒定白蛋白表達；

肝細胞誘導液包括：IMDM培養液、青霉素、鏈霉素、Hepes Buffer Solution、ITS+1Liquid Media Supplement、dexamethasone和HGF。

4.根據權利要求2所述肝樣細胞成熟與擴增的方法，其特征在于，所述胚胎干細胞體外誘導間充質干細胞分化為肝樣細胞具體步驟為：胚胎干細胞培養體系中加RPMI基礎培養基補充1mM L-谷氨酰胺、0.5％v/v胎牛血清、100ng/ml激活素-A、25ng/ml Wnt3a，誘導培養2天；RPMI基礎培養基補充1mM L-谷氨酰胺、0.5％v/v胎牛血清、100ng/ml激活素-A、繼續誘導培養2天；接著培養基換成HCM基礎培養基，添加20ng/ml重組人骨形態發生蛋白、30ng/ml成纖維細胞生長因子-4，繼續誘導培養6天；HCM基礎培養基補加20ng/ml肝細胞生長因子，誘導培養5天；HCM基礎培養基補加10μg/ml human Oncostatin M，100nM地塞米松，誘導培養15天。

5.根據權利要求2所述肝樣細胞成熟與擴增的方法，其特征在于，所述誘導多能干細胞體外誘導分化為肝樣細胞具體步驟為：CDM-PVA培養基(250mL DMEM-F12，250mL IMDM，0.5g聚乙烯醇，5ml濃縮脂類，20μL硫代甘油，25μg/mL轉鐵蛋白，10μg/L重組人胰島素，100units/mL青霉素，100mg/mL鏈霉素)，補加10ng/mL激活素-A和12ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，培養2天；CDM-PVA培養基，補加100ng/mL激活素-A，100ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，10ng/mL重組人骨形態發生蛋白4，10μM LY294002，3μM CHIR99021，培養24小時；CDM-PVA培養基，補加100ng/mL激活素-A，100ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，10ng/mL重組人骨形態發生蛋白4，10μM LY294002，培養24小時；RPMI-B27培養基(490mL RPMI 1640，補加10mL B27，5mL NEAA，100units/mL青霉素，100mg/mL鏈霉素)，補加100ng/mL激活素-A，100ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，誘導培養24小時；RPMI-B27培養基，補加50ng/mL激活素-A，誘導培養3天；RPMI-B27培養基，補加20ng/mL重組人骨形態發生蛋白4，10ng/mL成纖維細胞生長因子-10，誘導培養3天；Hepatocyte Basal Medium，補加50ng/ml HGF，30ng/mlhuman Oncostatin M，誘導培養3天。

6.根據權利要求1所述肝樣細胞成熟與擴增的方法，其特征在于，所述FAH基因缺陷大鼠肝臟載體通過受精卵顯微注射下使用CRISP Cas9基因敲除方法獲得。