[發明專利]氯氮平個體化用藥基因檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201811226793.3
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN109207582A
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發明（設計）人: 陸軍;王斐;景丹丹;姜昕
• 申請（專利權）人: 南通中科基因醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6848
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 盧海洋

1.一種氯氮平個體化用藥基因檢測試劑盒，其特征在于，包括以下成分:CYP2D6*2(886C>A)、CYP2D6*41(985+39G>A)、CYP2D6*10(100C>T)和MC4R(57882787C>T)；位點擴增和測序引物4對、CYP2D6Z大片段PCR擴增引物1對、PCR擴增試劑、PCR產物純化試劑和DNA測序試劑；

各引物的核苷酸序列如SEQ NO.3-12所示，具體見表1：

表1

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，包括以下成分：

(1)CYP2D6*2(886C>A)、CYP2D6*41(985+39G>A)、CYP2D6*10(100C>T)和MC4R(57882787C>T)位點區域PCR擴增與測序引物4對，CYP2D6Z大片段PCR擴增引物1對，引物序列參見表1；

(2)PCR擴增試劑：Taq酶混合液，包括dNTP、l0×PCR反應緩沖液和MgCl2；

(3)PCR產物純化試劑：SAP酶混合物，包括SAP酶、ExoI酶和去離子水；

(4)測序試劑：包括BigDye mix、EDTA、乙醇溶液和Hi-Di。

3.采用如權利要求1或2所述試劑盒進行非疾病診斷目的檢測氯氮平個體化用藥基因的檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)提取樣本的基因組DNA；

(2)擴增CYP2D6*2(886C>A)、CYP2D6*41(985+39G>A)、CYP2D6*10(100C>T)位點，使用MC4R引物擴增MC4R(57882787C>T)位點；由于CYP2D6基因存在假基因，該試劑盒采用巢式PCR擴增，先用CYP2D6Z大片段PCR擴增引物進行大片段擴增，在此擴增產物基礎上分別擴增CYP2D6*2/*41/*10位點，從而提高反應特異性；

(3)PCR產物純化；

(4)DNA測序反應。

4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取樣本的基因組DNA；

(2)CYP2D6*2(886C>A)、CYP2D6*41(985+39G>A)、CYP2D6*10(100C>T)和MC4R(57882787C>T)位點的PCR擴增

針對CYP2D6*2(886C>A)、CYP2D6*41(985+39G>A)、CYP2D6*10(100C>T)和MC4R(57882787C>T)位點按照表1設計引物進行PCR擴增；

由于CYP2D6基因存在假基因，該試劑盒采用巢式PCR擴增，先用CYP2D6Z大片段PCR擴增引物進行大片段擴增，在此擴增產物基礎上分別擴增CYP2D6*2/*41/*10位點；

每個反應體系為總體積16μL，包含Taq酶混合液7.5μL(dNTP、l0×PCR反應緩沖液、MgCl₂)、去離子水5.5μL、引物對(l0uM)1μL、基因組DNA(100ng/ul)1ul；反應條件為95℃15分鐘，進行14個循環(-0.5℃/循環)的94℃30秒，63℃30秒，72℃45秒；然后進行30個循環的94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，最后進行72℃10分鐘；

(3)PCR產物純化

每個反應體系為總體積5.6μL；PCR產物4μL，再加入1.6μL SAP酶混合物(SAP酶、ExoI酶、去離子水)；反應條件為37℃45分鐘，85℃15分鐘；

(4)DNA測序反應

每個反應的體系為總體積10μL，PCR酶解產物1μL、BigDye mix(Bigdye、5×seq)2.2μL和測序引物0.5μL，加水補足10μL；反應條件為96℃1min，進行33個循環的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min；

反應結束后每管內加入2.5μL EDTA，30μL100％乙醇，蓋好，震蕩4次，避光靜置15分鐘，3860rpm，25℃離心40min，吸棄上層液體；加入100μL 70％預冷乙醇，蓋好，3860rpm，25℃離心15分鐘，吸棄上層液體；讓酒精在室溫揮發干凈，加入8μL Hi-Di溶解DNA；在PCR儀上變性：95℃4分鐘，冰上靜置4分鐘；放入測序儀中。