[發明專利]一種高效提取子宮內膜間充質干細胞的方法及其應用

在審

• 申請號: 201811226089.8
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN109251890A
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 中晶生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/28;A61P15/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種子宮內膜間充質干細胞制備及在卵巢早衰、子宮內膜損傷等治療中應用的方法，包括采用月經杯收集經血為原料；通過篩網過濾分離經血中的子宮內膜組織和經血液體；然后收集子宮內膜組織切碎后加入約10?20ml消化液，消化獲得單細胞懸液，并對其進行原代培養；對經血液體進行除菌處理，采用梯度離心法獲得中間薄膜層細胞，并對其進行原代培養；對獲得的原代子宮內膜間充質干細胞傳代培養即獲得子宮內膜間充質干細胞。將獲得的子宮內膜間充質干細胞用于卵巢早衰、子宮內膜損傷等相關疾病治療。使用本發明專利技術提供的子宮內膜間充質干細胞的提取方法，可維持子宮內膜間充質干細胞在體外長期培養過程，維持細胞形態、增殖能力、MSC表面標記表達、分化能力等。所用到的方法簡單易行，操作方便，并且能最大量獲得所需的干細胞，并培養成功。

技術領域

本發明涉及干細胞技術領域，特別是涉及一種從廢棄經血中制備子宮內膜間充質干細胞及在卵巢早衰、子宮內膜損傷等治療中應用的方法。

背景技術

間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cell, MSC）是一種成體干細胞，具有自我更新能力和多向分化潛能，而且免疫原性低，異體移植無免疫排斥反應或反應較弱，因此在再生醫學領域具有巨大的潛能。人的子宮內膜是一個高度再生組織，在育齡期婦女中要經歷400多次的增殖、分化和脫落。近年越來越多的研究表明，子宮內膜組織中存在一小群具有強大增殖和多向分化潛能的干細胞，可不斷分裂增殖，及時補充脫落的終末分化細胞，使子宮內膜始終保持自我更新和再生能力，這種成體干細胞被稱為子宮內膜間充質干細胞。該子宮內膜間充質干細胞具有典型的間充質干細胞特性：具有自我更新和多向分化潛能，且具有間充質干細胞特異的標記分子表達。從經血中分離間充質干細胞可避免倫理爭議，其來源豐富，變廢為寶，在臨床上可用于卵巢早衰、子宮內膜損傷等疾病治療，具有廣泛的應用價值。

目前，已有的經血中分離子宮內膜間充質干細胞的方法存在以下缺點：（1）月經血液高粘性和高滲透性，用水或銨鹽溶解紅細胞的效率很低，且不能協助分離脫落的子宮內膜組織，子宮內膜間充質干細胞易黏附。（2）對于大體積經血樣本，使用梯度離心法分離子宮內膜間充質干細胞需要大量淋巴細胞分離液，使得分離成本較高，不利于產業化生產；且有明顯的紅細胞污染和凝結快，這些都會顯著降低子宮內膜間充質干細胞的提取量。（3）對于子宮內膜間充質干細胞在卵巢早衰、子宮內膜損傷等疾病治療方面方法有待進一步完善。因此，目前從經血中分離間充質干細胞的技術存在成本高、效率低的問題；對子宮內膜間充質干細胞在卵巢早衰、子宮內膜損傷等疾病中的方法有待完善。

發明內容

本發明的目的是提供了一種高效獲得子宮內膜間充質干細胞及在卵巢早衰、子宮內膜損傷等治療中應用的方法。該方法能夠在較低成本的條件下，分離出大量、高質量的子宮內膜間充質干細胞，應用于產業化生產和臨床使用。

本發明所提供的人子宮內膜間充質干細胞的分離培養用培養基，包括動物細胞基礎培養基、胎牛血清（FCS）、表皮生長因子（EGF）和血小板衍生生長因子（PDGF）；所述胎牛血清的終濃度為1-200 mL/L，所述表皮生長因子的終濃度為0.1-150ng/ml，所述血小板衍生生長因子的終濃度為0.1-150ng/ml。

其中，所述胎牛血清的終濃度優選為10-100 mL/L，尤其優選為10-30 ml/L；所述表皮生長因子的終濃度優選為5-50ng/ml；所述血小板衍生生長因子的終濃度優選為5-50ng/mll。

所述動物細胞基礎培養基可為DMEM/F12、MCDB-201、DMEM、MEM、RPMI1640、DMEM、M199、BME和IMEM等中的任意一種或其任意組合。