[發明專利]一種高效提取子宮內膜間充質干細胞的方法及其應用

在審

• 申請號: 201811226089.8
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN109251890A
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 中晶生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/28;A61P15/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種從經血中制備子宮內膜間充質干細胞及在卵巢早衰、子宮內膜損傷等治療中應用的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）使用月經杯采集女性經期中第一天到第四天的經血作為原料；將采集到的經血倒入裝有保存液的無菌管中，4℃保存。

2.2）0-72小時內將浸泡在經血保存液中的經血運至實驗，通過100-200μm篩網將經血中的子宮內膜組織與經血液體分離，然后分別從子宮內膜組織與經血液體中收集人子宮內膜組織。

3.3）從子宮內膜組織中提取間充質干細胞：剪碎的子宮內膜中加入約1-4倍體積由0.05-2.5%的胰蛋白酶和0.05-2%的膠原酶組成的消化液，25℃—37℃消化15-60min，獲得單細胞懸液。

4.4）從過濾后的經血液體中分離間充質干細胞：過濾后的經血液體加入1-5倍青/鏈霉素及兩性霉素，置于冰箱2-8℃處理8-24 h。

5.5）過濾后的細胞沉淀中加入等體積生理鹽水混勻，緩慢平鋪于人淋巴細胞分離液的無菌離心管，1500-3000 rpm離心10-30min，收集中間白膜層細胞。

6.接種至培養瓶中，置于37℃、50ml/LCO₂和95％的相對空氣濕度孵箱中培養。

7.6）將步驟3）中處理8-24h的濾液應用ficoll分離法獲得中間薄膜層細胞，并對其進行原代培養。

8.7）將步驟5）和步驟6）分離獲得的有核細胞置于子宮內膜間充質干細胞培養基中進行選擇性培養，其梭形貼壁細胞即為所述子宮內膜間充質干細胞。

9.8）將步驟7）中獲得的子宮內膜間充質干細胞用于卵巢早衰、子宮內膜損傷等疾病的治療。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，經血中加入1-5倍體積含0.1%—5%青霉素、0.1%—5%鏈霉素及1-4μg/ml兩性霉素B的生理鹽水，混勻進行過濾。

11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，0-72小時內浸泡的子宮內膜使用100-200μm的篩網進行過濾分離，收集獲得子宮內膜組織；

如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，剪碎的子宮內膜加入1-4倍體積的5-100U/ml DNA酶、0.05-2.5%的胰蛋白酶和0.01-0.5%的膠原酶組成的消化液，并置于25℃—37℃消化15-60min，獲得單細胞懸液。

12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中，上清濾液中加入1-5倍體積含0.5%—25%青霉素、0.5%—25%鏈霉素及1-4μg/ml兩性霉素B，置于冰箱4℃處理24h。

13. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中，使用密度梯度離心方法收集白膜層，其收集過程采用1500-3000 rpm離心10-30min，離心采用緩慢停止的方式，收集后，種植于無菌培養用耗材中；

如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟6)中，將步驟3）中處理8-24h的濾液應用ficoll分離法獲得中間薄膜層細胞，并對其進行原代培養。

14.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5）和步驟6)中有核細胞合并進行選擇性培養，獲得梭形貼壁的細胞進行傳代培養。