[發(fā)明專利]一種高效提取子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811226089.8
• 申請(qǐng)日: 2018-10-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109251890A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中晶生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;A61K35/28;A61P15/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種從經(jīng)血中制備子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞及在卵巢早衰、子宮內(nèi)膜損傷等治療中應(yīng)用的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）使用月經(jīng)杯采集女性經(jīng)期中第一天到第四天的經(jīng)血作為原料；將采集到的經(jīng)血倒入裝有保存液的無(wú)菌管中，4℃保存。

2.2）0-72小時(shí)內(nèi)將浸泡在經(jīng)血保存液中的經(jīng)血運(yùn)至實(shí)驗(yàn)，通過(guò)100-200μm篩網(wǎng)將經(jīng)血中的子宮內(nèi)膜組織與經(jīng)血液體分離，然后分別從子宮內(nèi)膜組織與經(jīng)血液體中收集人子宮內(nèi)膜組織。

3.3）從子宮內(nèi)膜組織中提取間充質(zhì)干細(xì)胞：剪碎的子宮內(nèi)膜中加入約1-4倍體積由0.05-2.5%的胰蛋白酶和0.05-2%的膠原酶組成的消化液，25℃—37℃消化15-60min，獲得單細(xì)胞懸液。

4.4）從過(guò)濾后的經(jīng)血液體中分離間充質(zhì)干細(xì)胞：過(guò)濾后的經(jīng)血液體加入1-5倍青/鏈霉素及兩性霉素，置于冰箱2-8℃處理8-24 h。

5.5）過(guò)濾后的細(xì)胞沉淀中加入等體積生理鹽水混勻，緩慢平鋪于人淋巴細(xì)胞分離液的無(wú)菌離心管，1500-3000 rpm離心10-30min，收集中間白膜層細(xì)胞。

6.接種至培養(yǎng)瓶中，置于37℃、50ml/LCO₂和95％的相對(duì)空氣濕度孵箱中培養(yǎng)。

7.6）將步驟3）中處理8-24h的濾液應(yīng)用ficoll分離法獲得中間薄膜層細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行原代培養(yǎng)。

8.7）將步驟5）和步驟6）分離獲得的有核細(xì)胞置于子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，其梭形貼壁細(xì)胞即為所述子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞。

9.8）將步驟7）中獲得的子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞用于卵巢早衰、子宮內(nèi)膜損傷等疾病的治療。

10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，經(jīng)血中加入1-5倍體積含0.1%—5%青霉素、0.1%—5%鏈霉素及1-4μg/ml兩性霉素B的生理鹽水，混勻進(jìn)行過(guò)濾。

11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，0-72小時(shí)內(nèi)浸泡的子宮內(nèi)膜使用100-200μm的篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾分離，收集獲得子宮內(nèi)膜組織；

如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，剪碎的子宮內(nèi)膜加入1-4倍體積的5-100U/ml DNA酶、0.05-2.5%的胰蛋白酶和0.01-0.5%的膠原酶組成的消化液，并置于25℃—37℃消化15-60min，獲得單細(xì)胞懸液。

12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中，上清濾液中加入1-5倍體積含0.5%—25%青霉素、0.5%—25%鏈霉素及1-4μg/ml兩性霉素B，置于冰箱4℃處理24h。

13. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中，使用密度梯度離心方法收集白膜層，其收集過(guò)程采用1500-3000 rpm離心10-30min，離心采用緩慢停止的方式，收集后，種植于無(wú)菌培養(yǎng)用耗材中；

如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟6)中，將步驟3）中處理8-24h的濾液應(yīng)用ficoll分離法獲得中間薄膜層細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行原代培養(yǎng)。

14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5）和步驟6)中有核細(xì)胞合并進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，獲得梭形貼壁的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。