[發(fā)明專利]一種高效提取子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201811226089.8 | 申請(qǐng)日: | 2018-10-22 |
| 公開(kāi)(公告)號(hào): | CN109251890A | 公開(kāi)(公告)日: | 2019-01-22 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 不公告發(fā)明人 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 中晶生物技術(shù)股份有限公司 |
| 主分類號(hào): | C12N5/0775 | 分類號(hào): | C12N5/0775;A61K35/28;A61P15/00 |
| 代理公司: | 暫無(wú)信息 | 代理人: | 暫無(wú)信息 |
| 地址: | 101111 北京市大*** | 國(guó)省代碼: | 北京;11 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 間充質(zhì)干細(xì)胞 子宮內(nèi)膜 經(jīng)血 子宮內(nèi)膜損傷 子宮內(nèi)膜組織 卵巢 早衰 原代培養(yǎng) 發(fā)明專利技術(shù) 體外長(zhǎng)期培養(yǎng) 單細(xì)胞懸液 梯度離心法 中間薄膜層 表面標(biāo)記 傳代培養(yǎng) 分化能力 高效提取 疾病治療 培養(yǎng)成功 篩網(wǎng)過(guò)濾 細(xì)胞形態(tài) 增殖能力 干細(xì)胞 消化液 月經(jīng)杯 最大量 除菌 切碎 制備 應(yīng)用 細(xì)胞 消化 治療 | ||
1.一種從經(jīng)血中制備子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞及在卵巢早衰、子宮內(nèi)膜損傷等治療中應(yīng)用的方法,其特征在于,包括以下步驟:
1)使用月經(jīng)杯采集女性經(jīng)期中第一天到第四天的經(jīng)血作為原料;將采集到的經(jīng)血倒入裝有保存液的無(wú)菌管中,4℃保存。
2.2)0-72小時(shí)內(nèi)將浸泡在經(jīng)血保存液中的經(jīng)血運(yùn)至實(shí)驗(yàn),通過(guò)100-200μm篩網(wǎng)將經(jīng)血中的子宮內(nèi)膜組織與經(jīng)血液體分離,然后分別從子宮內(nèi)膜組織與經(jīng)血液體中收集人子宮內(nèi)膜組織。
3.3)從子宮內(nèi)膜組織中提取間充質(zhì)干細(xì)胞:剪碎的子宮內(nèi)膜中加入約1-4倍體積由0.05-2.5%的胰蛋白酶和0.05-2%的膠原酶組成的消化液,25℃—37℃消化15-60min,獲得單細(xì)胞懸液。
4.4)從過(guò)濾后的經(jīng)血液體中分離間充質(zhì)干細(xì)胞:過(guò)濾后的經(jīng)血液體加入1-5倍青/鏈霉素及兩性霉素,置于冰箱2-8℃處理8-24 h。
5.5)過(guò)濾后的細(xì)胞沉淀中加入等體積生理鹽水混勻,緩慢平鋪于人淋巴細(xì)胞分離液的無(wú)菌離心管,1500-3000 rpm離心10-30min,收集中間白膜層細(xì)胞。
6.接種至培養(yǎng)瓶中,置于37℃、50ml/LCO2和95%的相對(duì)空氣濕度孵箱中培養(yǎng)。
7.6)將步驟3)中處理8-24h的濾液應(yīng)用ficoll分離法獲得中間薄膜層細(xì)胞,并對(duì)其進(jìn)行原代培養(yǎng)。
8.7)將步驟5)和步驟6)分離獲得的有核細(xì)胞置于子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng),其梭形貼壁細(xì)胞即為所述子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞。
9.8)將步驟7)中獲得的子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞用于卵巢早衰、子宮內(nèi)膜損傷等疾病的治療。
10.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟1)中,經(jīng)血中加入1-5倍體積含0.1%—5%青霉素、0.1%—5%鏈霉素及1-4μg/ml兩性霉素B的生理鹽水,混勻進(jìn)行過(guò)濾。
11.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟2)中,0-72小時(shí)內(nèi)浸泡的子宮內(nèi)膜使用100-200μm的篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾分離,收集獲得子宮內(nèi)膜組織;
如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟3)中,剪碎的子宮內(nèi)膜加入1-4倍體積的5-100U/ml DNA酶、0.05-2.5%的胰蛋白酶和0.01-0.5%的膠原酶組成的消化液,并置于25℃—37℃消化15-60min,獲得單細(xì)胞懸液。
12.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟4)中,上清濾液中加入1-5倍體積含0.5%—25%青霉素、0.5%—25%鏈霉素及1-4μg/ml兩性霉素B,置于冰箱4℃處理24h。
14.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟5)和步驟6)中有核細(xì)胞合并進(jìn)行選擇性培養(yǎng),獲得梭形貼壁的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
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