[發明專利]一種檢測轉基因玉米MIR604的引物、探針及試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201811222873.1
• 申請日: 2018-10-19
• 公開（公告）號: CN109161585A
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 陳笑蕓;徐俊鋒;汪小福;彭城;徐曉麗;魏巍
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

本發明公開了一種轉基因玉米MIR604的RPA檢測引物與探針組合、試劑盒及檢測方法。引物組由2條特異性引物組成，其核苷酸序列如SEQ ID No：1～2所示，探針序列如SEQ ID No.3所示。檢測試劑盒包括檢測引物與探針溶液、Buffer A、Buffer B和陽性對照。檢測方法是采用特異性引物及探針在重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)、鏈置換DNA聚合酶和核酸外切酶的作用下，在37～42℃對樣品DNA模板進行擴增，通過對探針熒光信號收集的方法，判斷樣品是否含有轉基因玉米MIR604成分。本發明不需要特殊儀器，具有快速高效、操作簡便、靈敏度高、特異性強等特點，適合現場檢測。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及轉基因植物及其產品的檢測方法，具體涉及一種利用重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)快速檢測轉基因玉米MIR604的引物與探針組合、試劑盒和檢測方法。

背景技術

2016年全球轉基因作物種植面積高達1.851億公頃，比1996年商業化初期增長了100余倍。目前商業化種植的轉基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜。轉基因玉米MIR604是先正達公司研發的一種抗蟲轉基因玉米，已被我國政府批準進口用作加工原料。針對轉基因玉米MIR604開展快速精準的檢測方法研究，是轉基因生物安全管理相關法律法規順利實施的技術支撐和保障。

轉基因成分檢測技術主要分為兩大類：一類以外源DNA為檢測對象，如PCR、基因芯片等，另一類以外源基因表達的蛋白質為檢測對象，如ELISA、免疫試紙條等。在上述方法中，目前PCR技術應用最為廣泛，但基于PCR的轉基因檢測方法需要PCR儀、凝膠成像系統等專業儀器設備，且擴增和產物檢測時間較長(約3～4h)，難以達到現場快速檢測目的，因此，在實際工作中需要一種更加便捷、準確、且適用于現場操作的轉基因檢測新技術。

RPA技術是一種新型的基因擴增技術，主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37℃左右。重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應并在鏈置換DNA聚合酶作用下啟動DNA合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增，被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物。該技術的基本特點是：①恒溫擴增：整個擴增反應在恒溫條件(37～42℃)進行，不需要特殊儀器設備；②快速高效：整個擴增和產物檢測可在30分鐘內完成；③高特異性：重組酶與引物形成復合體，特異的尋找靶標序列，再加上探針的特異識別與信號收集，擴增特異性高；④高靈敏度：檢測極限可低至10個拷貝或更低；⑤鑒定簡便：通過擴增熒光曲線的有無，對擴增產物進行便捷的檢測。

RPA方法具有快速高效、操作簡便、特異性強、靈敏度高等特點，不需要特殊儀器，適合現場快速檢測，在轉基因植物檢測領域具有廣闊的應用前景。目前尚未有利用RPA方法檢測轉基因玉米MIR604的檢測方法和試劑盒。

發明內容

本發明的目的旨在提供一種RPA檢測轉基因玉米MIR604的引物和探針，以及一種能快速、簡便、特異的檢測轉基因玉米MIR604的方法和試劑盒。

本發明具體通過以下技術方案實現：

根據轉基因玉米MIR604的轉化體特異性的核苷酸序列，設計轉基因玉米MIR604的RPA檢測引物，所述的引物包括正向引物F和反向引物R，其核苷酸序列具體如下所示：

正向引物F：GCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCTGC(SEQ ID NO：1)；

反向引物R：TAAATAAATAAATACGACGCTTGCGCGAGACA(SEQ ID NO：2)。