[發明專利]一種叢枝菌根真菌的簡易保存方法

在審

• 申請號: 201811221229.2
• 申請日: 2018-10-19
• 公開（公告）號: CN109207367A
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發明（設計）人: 孫錦;孔鐳;劉銘銘;王戰;宮筱雯;張曉琳;楊雅蘭
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 韓正玉;徐冬濤

本發明提供了一種叢枝菌根真菌的簡易保存方法，屬于微生物保存技術領域。本發明提供的叢枝菌根真菌保存方法，包括以下步驟：1)采用濕篩傾析法和蔗糖離心法從盆栽擴繁菌劑中分離得到叢枝菌根真菌孢子，制得叢枝菌根真菌孢子懸浮液；2)以甘油、甘油和生理鹽水、海藻糖和蔗糖作為冷凍保護劑，分別與上述孢子懸浮液混合；3)將混合液裝入10ml離心管中，再將離心管裝入自封袋中并利用硅膠進行干燥；4)然后將離心管置于?20℃下預凍，最后置于?80℃下進行保存。本發明方法操作簡單，成本低廉，菌種活性保存效果較好，能成功地與寄主植物根系建立菌根共生體。

技術領域

本發明涉及微生物領域方面，具體涉及一種叢枝菌根真菌的簡易保存方法。

背景技術

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi，AMF)通過侵染根系皮層細胞形成大量的叢枝結構，與植物根系形成互惠共生體。它能通過龐大的菌絲網絡系統幫助寄主植物吸收各種營養元素，顯著改善植物營養狀況，提高植物的抗逆性，促進植物生長。然而，與其它菌根真菌不同，AMF是活體營養微生物，只能通過與寄主植物根系建立共生關系才能獲得供其生長發育的營養物質，完成其生活史，因此，AMF的保存方法具有特殊性。

目前，AMF最普遍的保存方法主要是活體盆栽保存法，因其能長期保持AMF的生物活性，但該法費時、費力，需要較大的空間和溫室條件，且還存在雜菌污染的風險，故不能被多數人使用。也有機構將AMF菌劑放置在4℃冰箱中保藏，但這種方法需要專門的設備，會占用大量空間，成本較高，且菌種活力下降較快，保存效果不佳。

發明內容

本發明是針對上述存在的技術問題提供一種叢枝菌根真菌的一種簡易保存方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

一種叢枝菌根真菌的保存方法，該方法包括如下步驟：

(1)制備叢枝菌根真菌孢子懸浮液；

(2)配制冷凍保護液，滅菌后將冷凍保護液與上述孢子懸浮液均勻混合；

(3)將混合液裝入離心管中，再將離心管裝入自封袋中并利用硅膠進行干燥；

(4)將離心管置于-20℃下預凍，最后置于-80℃下進行保存，使用時在水浴鍋中進行解凍。

本發明技術方案中：步驟(1)中所述的叢枝菌根真菌孢子懸浮液是通過以下步驟制備：

S1：將叢枝菌根真菌進行盆栽培養，3個月后收獲地下部分，置于陰涼處自然風干，得到叢枝菌根真菌擴繁菌劑；

S2：采用濕篩傾析法和蔗糖離心法從盆栽擴繁菌劑中分離得到叢枝菌根真菌孢子懸浮液。

本發明技術方案中：步驟(1)中所述的叢枝菌根真菌孢子懸浮液的濃度為30～200個/ml。

本發明技術方案中：步驟(2)中所述的冷凍保護液為甘油的水溶液、甘油的水溶液和生理鹽水的混合溶液、海藻糖溶液或蔗糖溶液。

本發明技術方案中：步驟(2)中甘油的水溶液中甘油的質量濃度為40～60％、生理鹽水的質量濃度為0.5～1.5％，所述的混合溶液中甘油的水溶液和生理鹽水混合的體積比為8：2、海藻糖溶液的濃度為0.2mol/L～0.5mol/L、蔗糖溶液的質量濃度為40～60％。

本發明技術方案中：所述叢枝菌根真菌孢子懸浮液與冷凍保護液的混合比例為1：1～3。

本發明技術方案中：步驟(2)中，所述滅菌在溫度121℃，相對壓力為0.12MPa下蒸汽滅菌10～30min。

本發明技術方案中：在步驟(3)中，所述干燥時間為24～48h。

本發明技術方案中：在步驟(4)中，所述預凍時間為12～24h；解凍的溫度為30～40℃；