[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)乳酸和3-羥基丁酸共聚酯的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2018-10-19
• 公開（公告）號: CN109295085A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李正軍;史理隴;笪央央;普楠
• 申請（專利權(quán)）人: 北京化工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P7/56;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;魏少偉

本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)乳酸和3?羥基丁酸共聚酯的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明公開的生產(chǎn)乳酸和3?羥基丁酸共聚酯的基因工程菌通過如下步驟獲得：敲除受體菌的poxB基因、pflB基因和aceEF基因；增加受體菌中phaA基因、phaB基因、phaC基因和pct基因編碼蛋白質(zhì)的含量。本發(fā)明的工程菌株能夠同時利用葡萄糖和乙酸合成乳酸和3?羥基丁酸共聚酯，并且重組菌在搖瓶培養(yǎng)中的聚合物產(chǎn)量能達(dá)到較高的水平，乳酸和3?羥基丁酸單體的比例可以通過改變葡萄糖和乙酸的濃度進(jìn)行控制，具有較好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)、基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種生產(chǎn)乳酸和3-羥基丁酸共聚酯的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，更具體地，涉及一種利用葡萄糖和乙酸為碳源生產(chǎn)乳酸和3-羥基丁酸共聚酯的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

乙酸，也叫醋酸、冰醋酸，為食醋主要成分，也是一種常見的化工產(chǎn)品。工業(yè)上主要通過乙醛氧化法、液態(tài)烴液相氧化法、甲醇羰基合成法等化學(xué)合成的手段生產(chǎn)乙酸。近年來，乙酸市場持續(xù)低迷，如果能開發(fā)乙酸的下游產(chǎn)品，延伸產(chǎn)業(yè)鏈，將會促進(jìn)乙酸產(chǎn)業(yè)發(fā)展。把乙酸用作微生物發(fā)酵的碳源，具有較好的應(yīng)用前景，已有一些文獻(xiàn)報道。

葡萄糖是自然界中分布最廣泛、含量最多的一種單糖，從微生物到高等動物包括人類等都能夠利用葡萄糖作為營養(yǎng)物質(zhì)。葡萄糖是目前發(fā)酵工業(yè)中最主要的碳源，由此消耗了大量的淀粉等糧食資源。自然界中存在大量的非糧食來源的木質(zhì)纖維素資源，其主要的分解產(chǎn)物有葡萄糖和木糖等。由于碳分解代謝物阻遏效應(yīng)，在葡萄糖和木糖同時存在的條件下，多數(shù)微生物優(yōu)先選擇利用葡萄糖，待葡萄糖耗盡之后才開始利用木糖生長。

在葡萄糖和乙酸混合物中，部分微生物例如谷氨酸棒桿菌能夠同時利用葡萄糖和乙酸生長，但是大腸桿菌等優(yōu)先選擇利用葡萄糖，葡萄糖耗盡后，才能利用乙酸生長。敲除大腸桿菌的葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(glucose phosphotransferase system,PTS)，可以解除碳分解代謝物阻遏效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)葡萄糖和乙酸的共利用，但是PTS缺失降低了細(xì)菌的生長速度。

聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)是一類由微生物在生長代謝不平衡條件下利用葡萄糖或者脂肪酸等碳源在細(xì)胞內(nèi)合成的高分子聚合物。在環(huán)境中的碳源匱乏時，細(xì)胞內(nèi)積累的PHA能夠被微生物分解利用。PHA具有生物可降解性和與石油來源的塑料等相似的材料學(xué)性質(zhì)，可以用作環(huán)境友好型的包裝材料和組織工程材料。過去幾十年，PHA的生產(chǎn)研究和應(yīng)用開發(fā)引起了科學(xué)界和工業(yè)界的廣發(fā)關(guān)注。迄今為止，已有數(shù)種PHA產(chǎn)品進(jìn)行了商業(yè)化的試生產(chǎn)。從結(jié)構(gòu)上講，PHA是由羥基脂肪酸單體聚合而成的，自然界中最常見的單體是3-羥基脂肪酸。2008年，日本科學(xué)家Taguchi等實(shí)現(xiàn)了乳酸(2-羥基丙酸)的微生物法聚合，利用大腸桿菌合成出乳酸和3-羥基丁酸共聚酯(P(LA-co-3HB))。在構(gòu)建的組合代謝路徑中，葡萄糖是合成乳酸和3-羥基丁酸共聚酯的碳源。葡萄糖通過糖酵解途徑之后生成丙酮酸，一部分丙酮酸由乳酸脫氫酶催化生成乳酸，進(jìn)而生成乳酰輔酶A被聚羥基脂肪酸酯合成酶聚合，另一部分丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A,之后生成3-羥基丁酰輔酶A被聚羥基脂肪酸酯合成酶聚合。所得重組大腸桿菌合成的共聚酯中，乳酸單體含量為6mol％。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何利用葡萄糖和乙酸兩種碳源合成乳酸和3-羥基丁酸共聚酯并對其單體比例進(jìn)行調(diào)控。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了重組菌的構(gòu)建方法，所述方法包括對受體菌進(jìn)行下述A1-A7的改造，得到所述重組菌；

A1、敲除所述受體菌的丙酮酸氧化酶基因(poxB基因，GeneBank號：NC_000913.3，Gene ID：946132)或抑制所述poxB基因的表達(dá)或抑制所述poxB基因編碼的蛋白質(zhì)的活性；