[發明專利]一種檢測血漿游離DNA中肺癌相關突變基因的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201811215884.7
• 申請日: 2018-10-18
• 公開（公告）號: CN109295228B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 趙小剛;姜寧;王文娟;李培超;翟光喜;林貴梅
• 申請（專利權）人: 山東大學第二醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 陳桂玲

本發明涉及一種檢測血漿游離DNA中肺癌相關突變基因的試劑盒及其應用。本發明公開了血漿游離DNA中肺癌相關LRP1B、KMT2D、CSMD3突變基因及突變位點，以及檢測上述血漿游離DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3突變基因的試劑盒，該試劑盒包括根據上述LRP1B、KMT2D、CSMD3突變基因設計的特異性引物及特異性探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～68所示，以及緩沖液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，MgCl₂和DNA提取試劑盒。本發明首次揭示了LRP1B、KMT2D、CSMD3基因突變在非小細胞肺癌診斷中的應用，并能很好的鑒別腫瘤良惡性。

技術領域

本發明涉及一種檢測血漿游離DNA中肺癌相關突變基因的試劑盒及其應用，屬于生物技術和醫學領域。

背景技術

肺癌是目前世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，嚴重影響人們的身體健康。有研究數據統計顯示，目前到醫院就診和接受治療的肺癌患者中，80％以上到醫院就診時已為中晚期肺癌，早期肺癌(I期)僅占19.10％。早期肺癌通過手術等綜合治療，患者的5年生存率在90％以上，10年生存率接近70％。而中、晚期肺癌患者的5年生存率分別為30％和10％左右。因此，提高肺癌治愈率的有效方法就是：早期發現、早期診斷和早期治療。

影像學檢查是肺癌診斷的初步手段，胸部CT分辨率更高，目前已應用于健康查體，能發現很小的肺部病灶。從肺部病變的影像學表現，如分葉、毛刺、胸膜皺縮征等，可以初步判斷肺部陰影是惡性或良性腫瘤。但有時肺部病灶在胸部CT的表現不典型，從CT表現看很難區分病灶的良惡性。而血液腫瘤標志物檢測，如CEA、NSE、CYF-211的敏感性和特異性低，亦不能確診良惡性。這些因素給肺癌的診斷帶來困難。

目前肺癌確診的主要手段仍是病理學診斷。取得病理的方法包括纖維支氣管鏡、經皮肺穿刺活檢等。纖維支氣管鏡檢查，在氣管內可發現中心型肺癌在氣管內的形態，并可取得病理，但檢查有痛苦，存在獲取組織量少、假陰性的可能。一些位于肺周邊的病變，纖維支氣管鏡亦無法探查到。另一種常用的經皮肺穿刺活檢，是一種有創性操作，有出血、感染、氣胸等風險，且穿刺組織量較少，亦有假陰性的可能性，甚至有腫瘤細胞通過針道轉移的風險。這兩種方法有取得病理的可能，但亦有風險。

理想的診斷方法應為操作簡單、創傷較小、樣本獲取容易、陽性率高。血漿游離DNA(cellfreeDNA，cfDNA)是細胞通過細胞凋亡、壞死等途徑釋放至外周血中的DNA片段。健康人的cfDNA主要來自骨髓細胞、淋巴細胞以及正常的組織細胞。對于患腫瘤的病人，腫瘤細胞同樣會通過該途徑將腫瘤細胞的DNA片段釋放至外周血，這種DNA片段稱為循環腫瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)，大小約150-200bp。血漿游離的ctDNA中包含了腫瘤的遺傳信息，對于疾病的診斷、治療和監測預后有重要意義。高通量測序是目前研究ctDNA的高效手段，但檢測花費較高，檢測發現的突變基因是否與肺癌相關，亦難以確定。

實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環后產物總量的方法。在PCR反應體系中加入引物和特異性熒光探針，將報告熒光基團和淬滅熒光基團標記在寡核苷酸探針兩端。探針完整不被破壞時，5’端的報告基團發射的熒光信號會被3’端的淬滅基團吸收。而在PCR反應擴增時，Taq DNA聚合酶將與模板結合的探針酶切降解，使探針的淬滅基團與報告基團分離，發出熒光信號，實現熒光信號積累和PCR產物形成的同步。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明公開了血漿游離DNA中肺癌相關突變基因及突變位點，其中肺癌相關突變基因包括LRP1B、KMT2D、CSMD3突變基因，提供了一種檢測血漿游離DNA中肺癌相關LRP1B、KMT2D、CSMD3突變基因的試劑盒，該試劑盒能夠快速、便捷、準確的檢測血漿游離DNA中LRP1B、KMT2D、CSMD3基因的突變情況。