[發明專利]一種高特異性3-甲基喹惡啉-2-羧酸多克隆抗體的制備方法

在審

• 申請號: 201811215184.8
• 申請日: 2018-10-18
• 公開（公告）號: CN111072782A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 劉冰;楊艷玲;生威;王碩
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C07K14/795;C07K14/765;C07K14/77;C07D241/44;G01N33/68
• 代理公司: 天津合志慧知識產權代理事務所(普通合伙) 12219
• 代理人: 張勇

本發明提供了一種高特異性3?甲基喹惡啉?2?羧酸(MQCA)多克隆抗體的制備方法，屬于免疫分析技術。所述多克隆抗體是由3?甲基喹惡啉?2?羧酸(MQCA)半抗原與載體蛋白結合，免疫動物制成，所述3?甲基喹惡啉?2?羧酸(MQCA)半抗原是采用活化酯法將3?甲基喹惡啉?2?羧酸(MQCA)與4?氨基丁酸連接制成。本發明制備的3?甲基喹惡啉?2?羧酸(MQCA)多克隆抗體具有較高的特異性，填補了3?甲基喹惡啉?2?羧酸(MQCA)高特異性多克隆抗體制備研究方向的空白。

技術領域

本發明屬于小分子化合物免疫分析技術領域，涉及一種喹噁啉類 抗菌藥物的高特異性多克隆抗體的制備方法。

背景技術

喹乙醇一種理想的飼料添加劑，是喹噁啉類二氧化物，它是一種 具有促生長作用的藥物性添加劑，具有抗菌與蛋白同化作用，兼有促 進生長作用。3-甲基喹惡啉-2-羧酸(MQCA)是包括喹乙醇，乙酰甲 喹，喹烯酮在內的喹惡啉類藥物的主要代謝物之一。喹乙醇常在水產 養殖中用作飼料添加劑促生長及用于淡水魚類出血性敗血癥的治療， 一度有“水產瘦肉精”的美譽。然而喹乙醇的過度使用和不當使用容 易造成水產動物急性和慢性蓄積型中毒，如捕撈和運輸過程中大批量 死亡，出現腹水和出血癥，長期過量添加有致突變，致畸作用。這類 已中毒的魚或未出現中毒癥狀但體內蓄積了高劑量喹乙醇的魚被人食用后，將在人體內蓄積對人有潛在的致畸，致癌，致突變作用，嚴 重危害人體健康。2001年農業部第168公告和2005年獸藥典都明 確規定禁止喹乙醇用于水產養殖中。因此，喹乙醇的殘留監控對水產 品質量安全具有重大意義。喹乙醇經消化道吸收后，大部分經腎隨尿排出，少部分隨糞便以原形體排出體外。因此，喹惡啉類藥物很少殘 留在組織中，單獨檢測喹乙醇原藥殘留情況不能如實反應喹乙醇的殘 留情況。喹乙醇能在動物體內迅速代謝成十多種代謝產物，其中主要 代謝產物為MQCA，能在體內穩定存在，引起代謝物在動物組織殘 留。1991年，世界糧農組織和世界衛生組織(FAO/WHO)將MQCA 作為喹乙醇的殘留標示物。因此同時檢測喹乙醇原藥及其殘留標示物 MQCA能準確地反應出喹乙醇的殘留情況。另外，MQCA還是喹惡 啉類藥物喹烯酮，乙酰甲喹的主要代謝物，對MQCA的殘留檢測更 能如實地反應出喹惡啉類藥物的殘留情況。

目前關于喹乙醇及其代謝物的檢測方法有很多，對MQCA的殘 留的主要檢測手段為高效液相色譜法為基礎的儀器分析方法以及以 抗體為基礎的免疫分析方法。傳統儀器方法存在前處理復雜，儀器和 相應配套費用昂貴，無法大規模進行平行樣同時檢測等缺點。酶聯免 疫分析法具有方法簡單，方便訊速，特異性強等優點，在MQCA殘 留檢測中還沒有廣泛應用，有良好的發展前景。

在酶聯免疫分析法中，半抗原及人工抗原的合成通常是制備抗體 的關鍵步驟，所以本發明的關進技術是半抗原的結構設計。3-甲基喹 惡啉-2-羧酸作為一種小分子物質不具有免疫原性，不能直接免疫動 物產生特異性抗體、必須合成突出分子立體結構特異性部位的半抗 原，并與大分子載體連接構成接合物，才能免疫動物產生針對性的特 異性抗體。這種半抗原與大分子載體的結合物稱為人工抗原。人工抗 原的制備不是任意的，包括結合位點、結合方式、載體種類、以及半 抗原與目標分析物任何結構上的差異如大小、形狀、成份、構型、構 象、極性、電子云密度等等在內的諸因素，都可能極大地影響著相應 抗體的性質，因此人工抗原的制備是決定產生其特異性抗體的關鍵。

發明內容

本發明旨在通過人工抗原的制備，建立一種高特異性3-甲基喹惡 啉-2-羧酸(MQCA)多克隆抗體的制備方法，為后續的研究夯實基 礎，以實現對3-甲基喹惡啉-2-羧酸(MQCA)的定量檢測。

為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

3-甲基喹惡啉-2-羧酸(MQCA)多克隆抗體的制備包括人工抗原 的制備和動物免疫過程，包括如下步驟：

1)3-甲基喹惡啉-2-羧酸(MQCA)半抗原的制備：