[發(fā)明專利]一種高特異性3-甲基喹惡啉-2-羧酸多克隆抗體的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811215184.8
• 申請(qǐng)日: 2018-10-18
• 公開（公告）號(hào): CN111072782A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉冰;楊艷玲;生威;王碩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/44
• 分類號(hào): C07K16/44;C07K14/795;C07K14/765;C07K14/77;C07D241/44;G01N33/68
• 代理公司: 天津合志慧知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 12219
• 代理人: 張勇

1.一種高特異性3-甲基喹惡啉-2-羧酸多克隆抗體的制備方法，其特征在于：包括如下步驟；

1)3-甲基喹惡啉-2-羧酸半抗原的制備：

稱取100～200mg 3-甲基喹惡啉-2-羧酸加入干燥的圓底燒瓶中，向其中加入5～7mL四氫呋喃，使其完全溶解，再加入300～400mg EDC和400～500mg NHS，常溫磁力攪拌過夜，制備成A液，取100～150mg 4-氨基丁酸，溶解于4～5mL 0.05mol/L，pH 9.6的碳酸鉀緩沖溶液，制備成B液；將B液加入到A液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2小時(shí)，停止反應(yīng)后，用三氯甲烷進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相；將收集的有機(jī)相在35℃下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾，蒸餾完成得到粉色物質(zhì)，用1～3mL展開劑，將得到的物質(zhì)溶解，用毛細(xì)管點(diǎn)樣于薄層板上，一般為圓點(diǎn)，點(diǎn)樣基線距底邊1.0～1.5cm，樣品點(diǎn)直徑一般不大于2mm，點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況決定，將點(diǎn)連成線即可；點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面；將點(diǎn)好樣品的薄層板放入展開缸的展開劑中，浸入展開劑的深度為距原點(diǎn)5mm為宜，密閉，待展開至距離另一底邊2～3cm即可，取出薄層板，晾干，在暗箱三用紫外線分析儀254nm下觀察，將需要的條帶刮下來，收集所有薄層板的硅膠沙，將收集的硅膠沙浸泡于乙酸乙酯中，渦旋震蕩，離心，取有機(jī)相，用0.22μm的有機(jī)膜將有機(jī)相過濾，重復(fù)洗滌3～5遍；收集有機(jī)相進(jìn)行45℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)，收集沉淀，進(jìn)行真空干燥；得到的物質(zhì)即為3-甲基喹惡啉-2-羧半抗原；

2)3-甲基喹惡啉-2-羧酸半抗原與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫原：

5～15mg半抗原置于小棕瓶中，放入轉(zhuǎn)子，加100～300uL N,N-二甲基甲酰胺中將其攪拌溶解，再加入10～20mg EDC和10～20mg NHS，磁力攪拌常溫過夜，制備成A液；將15～30mgKLH置于25ml圓底燒瓶中，溶解于5～6mL 0.05mol/L，pH 9.6的碳酸鈉緩沖溶液中，制成B液；將A液緩慢滴加反應(yīng)液B中，每1～2分鐘滴加5～10uL，邊滴加邊攪拌，加完后，4℃攪拌過夜；次日將上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h換一次透析液；透析后，得到免疫原1，即Hapten-KLH；稱取20～30mg半抗原置于小棕瓶中，放入轉(zhuǎn)子，加100～300uL N,N-二甲基甲酰胺中將其攪拌溶解，再加入30～35mg EDC和15～30mg NHS，磁力攪拌常溫過夜，制備成A液；將15～30mg OVA置于25mL圓底燒瓶中，溶解于2～6mL0.05mol/L，pH 9.6碳酸鈉緩沖溶液中，制成B液；將A液緩慢滴加反應(yīng)液B中，每2分鐘滴加5uL，邊滴加邊攪拌，加完后，4℃攪拌過夜。次日將上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h換一次透析液；透析后，得到免疫原2即，Hapten-OVA，稱取10～30mg半抗原置于小棕瓶中，放入轉(zhuǎn)子，加100～300uL N,N-二甲基甲酰胺中將其攪拌溶解。再加入10～30mg EDC和10～15mg NHS，磁力攪拌常溫過夜，制備成A液，將10～30mg BSA置于25mL圓底燒瓶中，溶解于2～6mL0.05mol/L，pH 9.6碳酸鈉緩沖溶液中，制成B液，將A液緩慢滴加反應(yīng)液B中，每2分鐘滴加5uL，邊滴加邊攪拌，加完后，4℃攪拌過夜，次日將上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h換一次透析液。透析后，得到免疫原3即，Hapten-BSA；

3)免疫動(dòng)物，制得3-甲基喹惡啉-2-羧酸多克隆抗體。