[發明專利]一種用于L-茶氨酸生產的基因工程菌及其發酵方法

有效

• 申請號: 201811215068.6
• 申請日: 2018-10-18
• 公開（公告）號: CN109370966B
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 范曉光;朱新雅;曹華杰;徐慶陽;張通;謝沛;劉博超;陳寧;謝希賢;張成林
• 申請（專利權）人: 天津科技大學;河南巨龍生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

本發明提供一種用于L?茶氨酸生產的基因工程菌及其發酵方法，在大腸桿菌(Escherichia coli W3110)基因組上單拷貝來源于T7噬菌體的RNA聚合酶基因T7RNAP，該基因由木糖啟動子控制；雙拷貝來源于Methylovorus mays的γ?谷氨酰甲胺合成酶基因gmas，該基因由T7啟動子控制；敲除木糖操縱子阻遏蛋白基因xylR；敲除琥珀酰CoA合成酶基因sucCD。使用本基因工程菌發酵L?茶氨酸的產量可達40g/L，糖酸轉化率可達到25％。本發明提供的L?茶氨酸生產方法具有原料價格低廉，周期短，操作簡便，綠色環保，產率較高的優點，具有良好的工業應用價值。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，具體而言，涉及一種用于L-茶氨酸生產的基因工程菌及其發酵方法。

背景技術

L-茶氨酸(L-Theanine)，又名谷氨酸γ-乙基酰胺，是茶葉中特有的游離氨基酸，占茶葉總游離氨基酸50％以上。作為茶葉甘甜味道的主要組成部分，茶氨酸在一定程度上決定著茶葉的質量。茶氨酸具有對人體健康的許多有益作用，包括促進大腦的學習和記憶功能，預防心血管疾病，抑制脂肪積累等。此外，茶氨酸還可以增強風味，抑制食品中的苦味和辣味，減輕澀味，因此已被廣泛應用于制藥和食品行業。

目前茶氨酸的主要制備方法主要包括提取法和化學合成法。從茶葉或茶葉廢渣中提取茶氨酸(ZL201510578407.7、ZL201210341844.3、ZL 201510304960.1、ZL200310109053.9)普遍存在提取步驟繁瑣、有機溶劑使用較多、提取收率和產品純度低等問題，不能滿足大規模生產需求。化學法合成茶氨酸(ZL201110225339.8、ZL200510122360.X、ZL201310485626.1)則普遍存在反應條件苛刻、有毒試劑使用較多、產物存在外消旋體等問題，產品難以在食品行業中應用。

微生物酶促合成是近幾年新興的茶氨酸合成方法。現有技術中，ZL201310302347.7報道了通過化學合成獲得γ-谷氨酰轉肽酶的基因，并以大腸桿菌為宿主菌構建一種過量表達γ-谷氨酰轉肽酶的基因工程菌，以重組酶作用于不同濃度的谷氨酰胺和乙胺鹽酸鹽得到L-茶氨酸。ZL201410325370.2報道了使用保藏編號為CCTCCNO：M2014254的硝基還原假單胞菌NTLC4.002為出發菌株制備細胞、細胞轉化谷氨酰胺和乙胺制備天然茶氨酸。201510973289.X報道了以γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶為催化劑，以L-谷氨酸鈉、乙胺鹽酸鹽和少量ATP為底物合成L-茶氨酸。ZL201210235889.2報道了使用從茶樹根際土壤篩選得到的近玫色鎖擲孢酵母生產γ-谷氨基甲酰胺合成酶，再用該酶催化L-谷氨酸鈉、乙胺鹽酸鹽和ATP生產L-茶氨酸。

現有微生物酶促合成茶氨酸包括產酶菌株的培養和酶促反應制備茶氨酸兩個過程，且需要使用價格較高的谷氨酰胺、谷氨酸鹽和ATP為原料，因此生產成本與提取法和化學法相比并無優勢。目前為止，尚未見以葡萄糖為原料通過微生物發酵制備L-茶氨酸的報道。鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種糖酸轉化率高、菌株穩定好的用于L-茶氨酸生產的基因工程菌及其發酵方法。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：

一種用于L-茶氨酸生產的基因工程菌，其特征在于：在大腸桿菌Escherichiacoli W3110基因組上單拷貝來源于T7噬菌體的RNA聚合酶基因T7RNAP，該基因由木糖啟動子P_xylF控制；雙拷貝來源于Methylovorus mays的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas，該基因由T7啟動子控制；敲除木糖操縱子阻遏蛋白基因xylR；敲除琥珀酰CoA合成酶基因sucCD。

一種用于L-茶氨酸生產的基因工程菌，構建方法如下：