[發明專利]一種用于L-茶氨酸生產的基因工程菌及其發酵方法

有效

• 申請號: 201811215068.6
• 申請日: 2018-10-18
• 公開（公告）號: CN109370966B
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 范曉光;朱新雅;曹華杰;徐慶陽;張通;謝沛;劉博超;陳寧;謝希賢;張成林
• 申請（專利權）人: 天津科技大學;河南巨龍生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

1.一種用于L-茶氨酸生產的基因工程菌，其特征在于：在大腸桿菌Escherichia coliW3110基因組上單拷貝來源于T7噬菌體的RNA聚合酶基因T7RNAP，T7RNAP的核苷酸序列見序列表1，該基因由木糖啟動子控制；雙拷貝來源于Methylovorus mays的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas，gmas的核苷酸序列見序列表2，該基因由T7啟動子控制；敲除木糖操縱子阻遏蛋白基因xylR；敲除琥珀酰CoA合成酶基因sucCD。

2.一種構建權利要求1所述的用于L-茶氨酸生產的基因工程菌的方法，其特征在于：步驟如下：

(1)在大腸桿菌Escherichia coli W3110基因組上lacI-lacZ位點單拷貝來源于T7噬菌體的RNA聚合酶基因T7RNAP，核苷酸序列見序列表1，該基因由木糖啟動子P_xylF控制；

(2)在Escherichia coli W3110基因組上yghX及yeeP位點雙拷貝來源于Methylovorusmays的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas，核苷酸序列見序列表2，該基因經過密碼子優化并由T7啟動子控制；

(3)敲除Escherichia coli W3110的木糖操縱子阻遏蛋白基因xylR，解除木糖啟動子受到的反饋調節作用；

(4)敲除Escherichia coli W3110的琥珀酰CoA合成酶基因sucCD，增加α-酮戊二酸到谷氨酸的代謝流量。

3.根據權利要求2所述的用于L-茶氨酸生產的基因工程菌構建方法，其特征在于：所述步驟(1)是以E.coli W3110 ATCC27325基因組為模板，根據其lacI-lacZ基因的上下序列設計上游同源臂引物UP-lacI-lacZ-S、UP-lacI-lacZ-A和下游同源臂引物DN-lacI-lacZ-S、DN-lacI-lacZ-A，并PCR擴增其上下游同源臂片段；通過基因合成獲得T7RNAP基因序列，其中包含木糖啟動子P_xylF，根據其T7RNAP基因序列設計引物T7RNAP-S、T7RNAP-A，并PCR擴增T7RNAP片段；上述片段通過重疊PCR的方法獲得T7RNAP基因的整合片段，上游同源臂-P_xylF-T7RNAP-下游同源臂；設計引物gRNA-lacI-lacZ-S和gRNA-lacI-lacZ-A擴增包含靶序列的DNA片段，與線性化的pGRB載體重組后獲得重組的pGRB-lacI-lacZ；將整合片段和pGRB-lacI-lacZ電轉化至含有pREDCas9載體的E.coli W3110感受態細胞中，將電轉化后復蘇培養的菌體涂布于含氨芐青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃過夜培養后利用PCR驗證陽性重組子，再消除用于基因編輯的pGRB-lacI-lacZ；

UP-lacI-lacZ-S的核苷酸序列見序列表5、UP-lacI-lacZ-A的核苷酸序列見序列表6、下游同源臂引物DN-lacI-lacZ-S的核苷酸序列見序列表7、DN-lacI-lacZ-A的核苷酸序列見序列表8，引物T7RNAP-S的核苷酸序列見序列表9、T7RNAP-A的核苷酸序列見序列表10，引物gRNA-lacI-lacZ-S的核苷酸序列見序列表11、gRNA-lacI-lacZ-A的核苷酸序列見序列表12、pGRB載體的核苷酸序列見序列表3、pREDCas9載體的核苷酸序列見序列表4。