[發(fā)明專利]植物內源性植物磺肽素含量的定量檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811214573.9
• 申請日: 2018-10-18
• 公開（公告）號: CN109374763B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發(fā)明（設計）人: 褚金芳;房爽;辛培勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;魏少偉

本發(fā)明公開了植物內源性植物磺肽素含量的定量檢測方法。本發(fā)明所提供的植物內源性植物磺肽素的檢測方法包括：1)向待測樣本中加入內標，內標添加量為S0，得到待測樣本與內標的混合物；內標為將磺肽素中的部分或全部原子替換為各自的同位素得到的化合物；2)提取混合物中磺肽素和內標，得到提取液；3)對提取液進行除雜和純化，得到提取物；4)用LC?MS/MS檢測提取物，得到磺肽素和內標的測得值，將磺肽素和內標的測得值分別記為Pd和Sd；根據公式1計算待測樣本中磺肽素的含量：磺肽素的含量＝Pd×S0/Sd(公式1)。本發(fā)明能夠實現對植物內源的植物磺肽素的準確定量分析，且簡便快捷、選擇性好、準確性高、靈敏度高。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及植物內源性植物磺肽素含量的定量檢測方法。

背景技術

植物磺肽素(Phytosulfokine,PSK-α)是近年發(fā)現的一種植物內源性多肽類激素。它的序列結構為Tyr(SO₃H)-Ile-Tyr(SO₃H)-Thr-Gln-OH，是一種帶有2個磺酸化修飾基團的五肽分子。作為一種翻譯后修飾的分泌型多肽，PSK-α發(fā)揮著細胞間信號分子的作用，對植物細胞分裂、葉綠素合成、下胚軸發(fā)育、不定芽的形成、木質部分化、體細胞胚胎發(fā)育、花粉細胞萌發(fā)及花粉管生長、生物脅迫響應等生理過程具有重要的調控功能。因此，對植物內源PSK-α進行準確的定性定量分析對研究其生理功能及分子作用機理具有非常重要的意義。

雖然PSK-α在植物中的生理作用在近些年受到越來越多的關注和研究，但是由于含量極低，植物材料基質復雜等原因，對PSK-α進行準確定量檢測一直是一個困擾性的難題。目前，已經報道的植物PSK-α定量檢測方法需要將植物細胞分離出來在培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)，利用PSK-α是分泌型多肽的特點，收集細胞分泌到培養(yǎng)基中的PSK-α進行純化富集和檢測。這類方法的最大問題在于不能準確地反映植物正常生長的生理狀態(tài)下內源PSK-α的含量。

發(fā)明內容

本發(fā)明所要解決的問題是克服現有檢測技術的不足，提供一種簡單、快速、準確的植物樣品中內源性植物磺肽素的檢測方法，可對植物磺肽素進行絕對定量。

本發(fā)明所提供的內源性植物磺肽素的檢測方法，包括1)和2)：

1)向待測樣本中加入同位素標記的植物磺肽素作為內標，將內標的添加量記為S0，得到所述待測樣本與所述內標的混合物；所述內標為將植物磺肽素中的部分或全部原子替換為各自的同位素得到的化合物；

2)提取所述混合物中植物磺肽素和所述內標，得到提取物；

3)檢測所述提取物中的植物磺肽素和所述內標的含量，得到植物磺肽素和所述內標的測得值，將植物磺肽素和所述內標的測得值分別記為Pd和Sd；根據公式1計算所述待測樣本中植物磺肽素的含量：

所述待測樣本中植物磺肽素的含量＝Pd×S0/Sd(公式1)。

步驟2)具體可包括：向所述混合物中添加提取溶劑，得到提取液；裂解所述提取液中細胞，得到裂解產物；利用含有胺基的物質富集純化所述裂解產物中的植物磺肽素和所述內標，得到含有植物磺肽素和所述內標的提取物，即所述提取物。

所述提取溶劑為可以溶解植物磺肽素的液體。

所述提取溶劑具體可為甲醇水溶液、甲醇、乙腈或乙腈水溶液。所述甲醇水溶液中甲醇的體積百分比含量可大于等于20％小于100％。所述甲醇水溶液中甲醇的體積百分比含量進一步可大于等于50％小于等于80％。所述甲醇水溶液中甲醇的體積百分比可為80％。所述乙腈水溶液中乙腈的體積百分比含量可大于等于20％小于100％。所述乙腈水溶液中乙腈的體積百分比含量可為50-80％。所述乙腈水溶液中甲醇的體積百分比可為80％。