[發明專利]一種牛支原體抗體光激化學發光免疫檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201811209344.8
• 申請日: 2018-10-17
• 公開（公告）號: CN109724965A
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發明（設計）人: 梁望旺;吳勝昔;曾政;李俊萱;李令臣;魯友銘;侯力嘉;藺露;陳忠瓊;徐緣;李紅
• 申請（專利權）人: 重慶市動物疫病預防控制中心;重慶理工大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N21/64;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 重慶博凱知識產權代理有限公司 50212
• 代理人: 張先蕓

本發明公開了一種牛支原體抗體光激化學發光免疫檢測試劑盒及其檢測方法，該試劑盒包括牛支原體P30蛋白單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG偶聯的受體微珠、帶有His標簽的牛支原體P30蛋白抗原和鎳螯合的供體磁珠。本發明采用基因工程技術制備了牛支原體P30外膜蛋白，采用PEG1500細胞融合技術制備了牛支原體P30蛋白單克隆抗體，將純化后的重組P30蛋白作為抗原和制備的單克隆抗體間的相互作用，通過樣品中抗體與單克隆抗體競爭性結合重組P30蛋白，建立競爭性牛支原體抗體AlphaLISA的檢測方法。該檢測方法檢測時間短，特異性好，靈敏度高，不需洗滌，操作簡便，檢測成本低。

技術領域

本發明涉及獸醫學、免疫學及生物制品學領域，特別的涉及一種牛支原體抗體光激化學發光免疫檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

牛支原體(Mycoplasma bovis，Mb)是目前發現最小和最簡單的能自主復制的原核可導致牛肺炎、乳腺炎、關節炎等多種疾病，造成巨大經濟損失，嚴重威脅著我國養牛業健康發展。目前，獸醫實驗室常用的牛支原體檢測方法：生物學檢測、分子生物學檢測以及免疫學檢測。生物學檢測主要是通過傳統的病原分離鑒定，由于支原體屬于兼性厭氧生物、對營養要求極其嚴格、而且培養周期較長(傳代培養需72小時以上才能繼代)，分離特別耗時；分子生物學檢測主要利用PCR技術，目前國外已根據有限的牛支原體基因序列建立了PCR、熒光PCR，但PCR和熒光PCR方法存在操作復雜、檢測時間長、所需設備昂貴等缺點，故難以在基層推廣；免疫學檢測方法則是目前大批量診斷牛群的牛肺炎支原體，最為常用和適用的實驗室診斷方法，但以全菌蛋白建立的ELISA特異性不好，與其它支原體有交叉反應，基于重組蛋白或單克隆抗體建立的ELISA靈敏性和特異性都較高，國外已開發成商品化試劑盒，但價格昂貴，檢測成本較高，國內發明專利“牛肺炎支原體的診斷試劑及應用”(專利號ZL20131 0071532.X)制備牛肺炎支原體重組蛋白，并作為包被抗原，建立間接ELISA法檢測牛肺炎支原體抗體，該方法檢測靈敏度較高，但操作步驟較繁瑣、需多次洗滌，容易產生非特異性反應。總之，這些方法雖然有各自的優點但都存在著一定的缺陷，很難在基層生產上推廣。因此，發明一種快速、簡便、高效的檢測方法對于牛肺炎支原體疫病的診斷和治療具有十分重要的意義。

光激化學發光免疫檢測技術(AlphaLISA，amplified luminescent proximityhomogeneous assay linked immunosorbent assay)是一種基于微珠的化學發光的新型均相檢測技術，與傳統的ELISA技術相比具有更高的敏感性、精確性、均一性、背景低、廣泛的動態檢測范圍，而且無需洗滌及樣本需求量極少等特點，非常便于快速篩選和自動化。近年來該技術已在醫學及分子生物學領域得到了廣泛的應用。但針對牛支原體AlphaLISA檢測國內外均未見報道。

發明內容

針對上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種牛支原體抗體光激化學發光免疫檢測試劑盒及其檢測方法，解決現有牛支原體檢測方法存在操作繁瑣和特異性差的問題。

為了解決上述技術問題，本發明采用了如下的技術方案：一種牛支原體抗體光激化學發光免疫檢測試劑盒，包括牛支原體P30蛋白單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG偶聯的受體微珠、帶有His標簽的牛支原體P30蛋白抗原和鎳螯合的供體磁珠；所述受體微珠具有發光功能，所述供體磁珠具有感光功能；所述牛支原體P30蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進一步，所述編碼所述牛支原體P30蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

應用上述牛支原體抗體光激化學發光免疫檢測試劑盒的檢測方法，具體包括以下步驟：

1)將山羊抗小鼠IgG偶聯的受體微珠和鎳螯合的供體磁珠分別用1×AlphaLISA稀釋劑將其濃度稀釋至100μg/ml；