[發明專利]一種羔羊小腸上皮細胞體外培養方法在審
| 申請號： | 201811208355.4 | 申請日： | 2018-10-17 |
| 公開（公告）號： | CN109294972A | 公開（公告）日： | 2019-02-01 |
| 發明（設計）人： | 劉軍花;孫大明;毛勝勇;朱偉云;劉理想 | 申請（專利權）人： | 南京農業大學 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204 | 代理人： | 孫斌 |
| 地址： | 210095 *** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 細胞體外培養 細胞 小腸 小腸上皮細胞 羔羊 貼壁 傳代 反芻動物 分離培養 緊密相連 貼壁細胞 細胞接種 細胞形態 細胞懸浮 多角形 除菌 單層 重懸 污染 清洗 采集 消化 生長 | ||
1.一種羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)羔羊屠宰后立即分離并采集小腸，將腸管外部與內部沖洗干凈；
(2)剔除腸系膜和脂肪組織，拋開腸管并剪成小段，進行涮洗；
(3)將腸管在容器中剪成碎片，繼續清洗直至上清清澈，離心去除清洗液；
(4)將組織碎片倒入無菌容器中中加入胰蛋白酶溶液，進行消化，消化后去掉消化液；
(5)消化后清洗組織碎片，將組織倒入新的無菌容器，倒入胰蛋白酶溶液消化，然后開始收集細胞；
(6)將含細胞的消化液用細胞濾網過濾到預先加入胎牛血清的離心管中收集細胞；
(7)將離心管中的細胞液離心棄上清，沉淀中加入培養基，吹打混勻；
(8)調節細胞密度種植到培養瓶，培養瓶培養箱中培養，換瓶培養以去除成纖維細胞；換瓶后繼續培養完成鋪層，即培養所得的細胞為羔羊小腸上皮細胞。
2.根據權利要求1所述的羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，其特征在于，步驟(1)所述將腸管外部與內部沖洗干凈為通過含有青霉素和鏈霉素的D-Hanks溶液將腸管外部與內部沖洗干凈。
3.根據權利要求1所述的羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，其特征在于，步驟(3)所述清洗直至上清清澈為加如含有三抗的D-Hanks溶液后顛倒混勻，靜置數秒倒掉上清，如此清洗直至上清清澈。
4.根據權利要求3所述的羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，其特征在于，所述三抗優選為青霉素，鏈霉素和兩性霉素B。
5.根據權利要求1所述的羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，其特征在于，步驟(4)所述加入胰蛋白酶溶液，進行消化，消化后去掉消化液，重復5-6次。
6.根據權利要求1所述的羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，其特征在于，步驟(5)所述消化后清洗組織碎片為用含有三抗的D-Hanks溶液清洗組織碎片3-4次。
7.根據權利要求1所述的羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，其特征在于，步驟(6)所述將含細胞的消化液用細胞濾網過濾到預先加入胎牛血清的離心管中收集細胞為每10分鐘收集1次，共收3-4次。
8.根據權利要求1所述的羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，其特征在于，步驟(7)所述離心為1500-2000r/min離心10-15分鐘，棄上清。
9.根據權利要求1所述的羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，其特征在于，步驟(8)所述調節細胞密度106/ml～107/ml后種植到培養瓶。
10.根據權利要求1所述的羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，其特征在于，步驟(8)所述培養所得的細胞，當細胞呈80％匯合時傳代培養，細胞傳代培養使用胰蛋白酶消化，時間為4～7分鐘。
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