[發明專利]一種羔羊小腸上皮細胞體外培養方法

在審

• 申請號: 201811208355.4
• 申請日: 2018-10-17
• 公開（公告）號: CN109294972A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 劉軍花;孫大明;毛勝勇;朱偉云;劉理想
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

本發明公開一種羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，包括如下步驟：組織采集、除菌、消化、清洗、收集、重懸、細胞接種、純化、傳代等過程。本發明改善反芻動物小腸上皮細胞體外培養方法，提供操作步驟簡單、花費較低的羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，易獲得大量純度較好、活力高、貼壁快的小腸上皮細胞，并且細胞被污染的情況大大降低，培養過程中均無發生細胞被污染的情況。普通小腸上皮細胞分離方法所得的細胞4天后貼壁細胞較少，細胞懸浮呈圓形；而本發明的小腸上皮細胞分離培養方法所得的細胞在4天后貼壁較多，細胞與細胞之間緊密相連、細胞形態呈單層“鋪石路”和多角形生長。

技術領域

本發明涉及細胞分離培養領域，尤其是一種羔羊小腸上皮細胞體外培養方法。

背景技術

反芻動物的小腸主要是消化和吸收過瘤胃的碳水化合物、蛋白、脂肪、微生物蛋白及氨基酸等。許多研究表明，小腸也起著重要的屏障和免疫作用，其發育狀態對保證動物健康非常重要的作用。因此，體外分離培養小腸上皮細胞對于研究小腸發育、生理功能、營養物質吸收機制以及免疫作用具有重要意義。但是，目前關于反芻動物小腸上皮細胞體外分離培養的技術還不完善。主要有以下兩方面因素，一是小腸中的食糜含有大量的微生物，在分離過程中不容易完全除菌，導致在培養過程中易受污染；二是目前存在的一些分離培養方法步驟繁瑣、花費較高，且分離培養效果不理想。

發明目的

發明內容：針對現有羔羊小腸上皮細胞體外培養方法存在的問題，本發明提供一種新型羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，包括組織采集、除菌、消化、清洗、收集、重懸、細胞接種、純化、傳代等過程。本發明的培養方法目的在于改善反芻動物小腸上皮細胞體外培養方法，提供操作步驟簡單、花費較低的羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，易獲得大量純度較好、活力高、貼壁快的小腸上皮細胞。

技術方案：為了實現上述目的，如本發明所述的一種羔羊小腸上皮細胞體外培養方法，包括如下步驟：

(1)羔羊屠宰后立即分離并采集小腸，將腸管外部與內部沖洗干凈；

(2)剔除腸系膜和脂肪組織，拋開腸管并剪成小段，進行涮洗；

(3)將腸管在容器中剪成碎片，繼續清洗直至上清清澈，離心去除清洗液；

(4)將組織碎片倒入無菌容器中中加入胰蛋白酶溶液，進行消化，消化后去掉消化液；

(5)消化后清洗組織碎片，將組織倒入新的無菌容器，倒入胰蛋白酶溶液消化，然后開始收集細胞；

(6)將含細胞的消化液用細胞濾網過濾到預先加入胎牛血清的離心管中收集細胞；

(7)將離心管中的細胞液離心棄上清，沉淀中加入培養基，吹打混勻；

(8)調節細胞密度種植到培養瓶，培養瓶培養箱中培養，換瓶培養以去除成纖維細胞；完成鋪層，即培養所得的細胞為羔羊小腸上皮細胞。

其中，步驟(1)所述將腸管外部與內部沖洗干凈為通過含有青霉素和鏈霉素的D-Hanks溶液將腸管外部與內部沖洗干凈。優選地，將羔羊屠宰后立即分離并采集30cm長的小腸，用含有10倍青霉素和10倍鏈霉素的D-Hanks溶液將腸管外部與內部沖洗干凈。

其中，步驟(3)所述清洗直至上清清澈為加入含有三抗的D-Hanks溶液后顛倒混勻，靜置數秒倒掉上清，如此清洗直至上清清澈。優選地，加含有1倍三抗濃度的D-Hanks溶液后顛倒混勻，靜置數秒倒掉上清，如此清洗直至上清清澈，最后一次1000r/min離心7分鐘，防止留有較多D-Hanks溶液。

其中，所述三抗為青霉素，鏈霉素和兩性霉素B。

其中，步驟(4)所述消化液胰蛋白酶溶液，進行消化，消化后去掉消化液，重復5-6次。

作為優選，消化時加入含0.25％的胰蛋白酶溶液，37℃消化10分鐘后丟掉消化液，