[發明專利]一種外周血來源單個核細胞的分離及誘導培養方法

在審

• 申請號: 201811208217.6
• 申請日: 2018-10-17
• 公開（公告）號: CN109402053A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 黎天英
• 申請（專利權）人: 廣州元帥生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發明公開了一種外周血來源單個核細胞的分離及誘導培養方法，屬于生物技術的細胞培養領域。所述方法包括：采集外周血，得到外周血來源單個核細胞；將細胞接種到包含RetroNectin和CD3Mab的培養器皿中，加入無血清細胞培養基培養。本發明無血清細胞培養基包含谷氨酰胺、巰基乙醇和IFN?γ，以及轉鐵蛋白、胰島素、丙酮酸鈉、膽固醇，可以促進單個核細胞大量擴增，獲得足夠數量的外周血來源單個核細胞。本發明同現有技術相比，采用先包被RetroNectin和CD3抗體，后加入INF?γ、IL?2以及SUPERGROW細胞培養添加物，通過包被使得細胞更持久的接觸抗體，用量少、激活效果更好。

技術領域

本發明屬于生物技術的細胞培養領域，具體涉及一種外周血來源單個核細胞的分離及誘導培養方法。

背景技術

免疫細胞，泛指能產生免疫應答的細胞，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、殺傷細胞、自然殺傷細胞等。目前，腫瘤和病毒的免疫治療技術慢慢地應用到臨床上。如腫瘤過繼免疫療法和“癌癥疫苗”等，這些方法主要通過采集宿主的自體免疫細胞，然后經過體外誘導刺激、擴增培養，然后回輸來提高患者的免疫能力，這些細胞主要有CIK細胞、NK細胞、DC細胞、DC-CIK細胞等。

但對于癌細胞病人來說，普遍存在免疫系統低下，不能有效地識別、殺滅癌癥細胞的情形；另一方面，癌癥細胞大量增殖，會進一步抑制患者的免疫功能；此外，癌癥細胞有多種機制來逃脫免疫細胞的識別與殺傷。癌癥的免疫治療就是借助分子生物學技術和細胞工程技術，提高癌癥的免疫原性，給機體補充足夠數量的功能正常的免疫細胞和相關分子，激發和增強機體抗腫瘤免疫應答，提高癌癥對機體抗癌癥免疫效應的敏感性，在體內、外誘導癌癥特異性和非特異性效應細胞和分子，達到最終清除癌癥的目的。

外周血是除骨髓之外的血液，來源豐富，采集方便。通過外周血分離培養的免疫細胞具有增殖速度快、安全性、持久性、適應性、全身性等特點，與傳統的放療等方法相比，通過主動免疫能夠激發全身性的抗腫瘤效應，作用范圍更加廣泛，特別適用于多發病灶或有廣泛轉移的惡性腫瘤；副作用很小。

目前免疫細胞主要來源于臍血、外周血、骨髓，但是臍血和骨髓來源的免疫細胞在體內存活率低、抗凋亡能力差、容易產生不良反應、安全性較差。而且同量的臍血、外周血、骨髓血中，從臍血和骨髓血中分離的免疫細胞較少。

而現有技術中分離培養外周血來源的免疫細胞時，常規方法通常效率低下，擴增能力不高，不容易獲得足夠的免疫細胞；此外，細胞活性低、在宿主體內的免疫功能達不到預期。此外，現有外周血來源的細胞分離方法中，不能充分分離紅細胞和免疫細胞，獲得的細胞誘導后狀態不是很好。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種提高機體免疫功能的外周血來源單個核細胞的分離及誘導培養方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種外周血來源單個核細胞的分離及誘導培養方法，包括下列步驟：

(1)無菌采集外周血，進行抗凝處理。

(2)加入淋巴細胞分離液，500×g～1500×g離心5～15min，取上層血漿和白膜層；再400×g～800×g低速離心5～15min，得到的細胞沉淀為外周血來源單個核細胞。

外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有單個核的細胞，包含免疫細胞、單核細胞(monocyte)、樹突狀細胞和其它少量細胞。

本發明中采用的淋巴細胞分離液是Lymphoprep分離液，STEMCELL Technologies公司生產。本領域技術人員也可以采用別的淋巴細胞分離液。