[發明專利]一種外周血來源單個核細胞的分離及誘導培養方法在審
| 申請號： | 201811208217.6 | 申請日： | 2018-10-17 |
| 公開（公告）號： | CN109402053A | 公開（公告）日： | 2019-03-01 |
| 發明（設計）人： | 黎天英 | 申請（專利權）人： | 廣州元帥生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/078 | 分類號： | C12N5/078 |
| 代理公司： | 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205 | 代理人： | 胡輝 |
| 地址： | 510520 廣東省廣*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 單個核細胞 外周血 無血清細胞培養基 誘導培養 包被 細胞培養 細胞培養添加物 丙酮酸鈉 谷氨酰胺 培養器皿 細胞接種 轉鐵蛋白 巰基乙醇 胰島素 膽固醇 抗體 擴增 生物技術 采集 激活 細胞 | ||
1.一種外周血來源單個核細胞的分離及誘導培養方法，其特征在于：包括下列步驟：
無菌采集外周血，進行抗凝處理；
加入淋巴細胞分離液，500×g～1500×g離心5-15min，取上層血漿和白膜層；再400×g～800×g低速離心5-15min，得到細胞沉淀；
將細胞接種到培養器皿中，所述培養器皿有包含RetroNectin和CD3Mab的緩沖液；
加入無血清細胞培養基，所述無血清細胞培養基的成分包括1～10mmol/L谷氨酰胺、30～70μmol/L巰基乙醇、500～1500u/mL的IFN-γ、0～800μ/ml轉鐵蛋白、0～800μ/ml胰島素、0～800μ/ml丙酮酸鈉、0～5μg/ml膽固醇；進行培養；
第0天加入500～1500u/mLIFN-γ、2～6％的SUPERGROW細胞培養添加物，24h后加入500～1500u/mL IL-2、2～6％SUPERGROW細胞培養添加物；
適時轉移細胞到新的培養器皿中，并補充無血清細胞培養基、IL-2以及SUPERGROW細胞培養添加物。
2.根據權利要求1所述的分離及誘導培養方法，其特征在于：抗凝處理是采用肝納素或EDTA進行抗凝處理。
3.根據權利要求1所述的分離及誘導培養方法，其特征在于：淋巴細胞分離液需要調整到室溫后，再加入到外周血中。
4.根據權利要求1所述的分離及誘導培養方法，其特征在于：緩沖液中RetroNectin的濃度為50～100mg/L，CD3Mab的濃度為5～10mg/L。
5.根據權利要求1所述的分離及誘導培養方法，其特征在于：所述無血清細胞培養基的成分包括2～8mmol/L谷氨酰胺、30～50μmol/L巰基乙醇、700～1300u/mL的IFN-γ、0～600μ/ml轉鐵蛋白、0～600μ/ml胰島素、0～600μ/ml丙酮酸鈉、0～3μg/ml膽固醇。
6.根據權利要求1所述的分離及誘導培養方法，其特征在于：第0天以及24h后，SUPERGROW細胞培養添加物的添加量為2～4％，按質量百分比計。
7.一種外周血來源單個核細胞，其特征在于：所述外周血來源單個核細胞是由權利要求1-6任一項分離得到。
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