[發(fā)明專利]研究離體百合植株同化物運(yùn)輸方向和路徑的熒光示蹤方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811204763.2
• 申請(qǐng)日: 2018-10-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109520978A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閔芮涵;夏宜平;張琳;吳昀;李世琦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

1.一種研究離體百合植株同化物運(yùn)輸方向和路徑的熒光示蹤方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)準(zhǔn)備植株和染料

(1.1)以生長(zhǎng)于培養(yǎng)基中的離體百合鱗莖作為待處理植株；

(1.2)配制質(zhì)量濃度為1～2mg/mL的CFDA熒光染料溶液；取120μl CFDA溶液，將醫(yī)用藥棉浸潤(rùn)至飽和；

(2)將染料引入植株

(2.1)選擇離體百合鱗莖的外層鱗片或葉片作為引入部位，用雙面刀在鱗片中部橫切0.3mm寬的楔形切口，深度以貫穿維管束為準(zhǔn)；或者，選擇百合離體植株的葉片作為引入部位，用耐水細(xì)砂紙將葉背末端輕輕摩擦至磨破維管束；

(2.2)將浸潤(rùn)了CFDA溶液的醫(yī)用藥棉塞進(jìn)鱗片切口，或平鋪在葉片維管束橫斷面處；用石蠟封口膜包裹鱗片或葉片后，先以丙酮浸潤(rùn)的醫(yī)用藥棉封塞再用石蠟封口膜包裹；最后用錫箔紙覆蓋鱗片或葉片的切口部位，防止CFDA見(jiàn)光分解；

(2.3)將處理后的離體百合鱗莖置于原培養(yǎng)基中，并以原培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)72h；

(3)采樣和制備切片

將百合離體植株從培養(yǎng)基中取出，洗凈并擦干后，在擬觀察部位取樣；

用雙面剃須刀片對(duì)取樣進(jìn)行徒手切片操作，切片立即置于滴有80％甘油液滴的載玻片；使切片平鋪在載玻片的中央，蓋上蓋玻片；

(4)觀察與拍照

用熒光顯微鏡觀察羧基熒光素在切片內(nèi)的分布圖像，根據(jù)觀察對(duì)象調(diào)整目鏡和物鏡倍數(shù)，對(duì)觀察到的樣本進(jìn)行拍照。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述CFDA熒光染料溶液中，溶質(zhì)為5(6)羧基熒光素酯，溶劑為丙酮，或者溶劑為DMSO與純水1∶1體積比的混合液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所用醫(yī)用藥棉需經(jīng)過(guò)121℃高溫滅菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中在取樣時(shí)，擬觀察部位是植株的鱗片、鱗莖盤(pán)、根或葉片。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中在取樣時(shí)，直接對(duì)植株的擬觀察部位徒手橫切或縱切，制備徒手切片；取樣的切片大小為0.2cm×1cm×2cm。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中在觀察時(shí)，采用488nm激光激發(fā)，并以藍(lán)色濾光片檢測(cè)圖像。