[發明專利]研究離體百合植株同化物運輸方向和路徑的熒光示蹤方法

在審

• 申請號: 201811204763.2
• 申請日: 2018-10-16
• 公開（公告）號: CN109520978A
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發明（設計）人: 閔芮涵;夏宜平;張琳;吳昀;李世琦
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

本發明涉及植物細胞生理學研究技術，旨在提供一種研究離體百合植株同化物運輸方向和路徑的熒光示蹤方法。包括：在離體百合鱗莖的外層鱗片切口或葉片維管束橫斷面敷以浸潤了CFDA溶液的醫用藥棉，以石蠟封口膜包裹后，用錫箔紙覆蓋；再以原培養條件繼續培養72h；在擬觀察部位徒手切片取樣，用熒光顯微鏡觀察CF在切片內的分布圖像并拍照。本發明采用的熒光染料CFDA對細胞無毒、化學惰性，且量子產率比較高，在盡量不損害卸載機制的情況下，可從活細胞水平適時追蹤不同發育時期百合鱗莖內同化物的運輸方向和路徑，比傳統的顯微放射自顯影技術更安全、更簡單。不需樣品的特殊處理、成本低廉，可快速、有效地獲得理想的標記結果。

技術領域

本發明涉及植物細胞生理學研究技術，尤其涉及一種基于離體模式體系的百合小鱗莖發育過程中同化物運輸方向和路徑的熒光示蹤方法。

背景技術

百合被譽為“球根花卉之王”，是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)所有種、亞種、變種、變型及品種的統稱。百合以觀花為主，是世界五大鮮切花之一。百合不僅可以觀花，其鱗莖含豐富的淀粉，部分品種可供食用或藥用，也可提取香料，應用價值廣泛。球根花卉種球自然繁殖率較低，童期長，因此新品種育種周期較長，例如，百合約12～15年，郁金香約20～30年。球根類植物的健壯生長與地下儲藏器官的大小直接相關，百合的地下部分--鱗莖有著極大的研究及開發價值。

“源”通常指植物體內能產生碳水化合物的光合組織，如葉片，莖等；“庫”主要為碳水化合物的積累和使用組織，碳水化合物用于生長、貯藏和呼吸作用等包括快速生長的組織、地下貯藏器官、根、遮陰狀態下或老的葉片等。離體體系下，碳水化合物的“源”包括來自葉的光合產物及培養基中的蔗糖成分，經韌皮部運輸進入鱗莖貯藏或進一步利用，不僅成為百合鱗莖品質和其他營養成分合成的基礎原料，而且可作為重要的信號分子參與鱗莖發育過程相關基因的表達、鱗莖“源-庫”角色的轉換以及整個植物源-庫活性的調節。高等植物中，物質運輸主要在維管束中進行，韌皮部則是負責同化物在體內運輸的主要組織。百合鱗莖“源-庫”角色轉化過程中，韌皮部同化物運輸途徑主要有共質體途徑(symplastic)和質外體途徑(apoplastic)。共質體途徑是通過胞間連絲進行的，質外體途徑則是跨膜運動，需要特定的載體和以及能量的驅動。百合鱗莖與以往所研究的單獨作為“源”，如成熟葉片，和單獨作為“庫”如發育的果實不同，前者只存在同化物的裝載和運出過程，后者則只存在同化物的卸載、積累和再利用等過程。百合鱗莖作為多年生的“源-庫”復合體，在其生長發育過程中會經歷多次“源-庫”角色的轉換，轉換過程中碳水化合物的代謝對于植物的生長及開花的品質具有重要的作用，因此探明百合鱗莖源庫轉化過程中同化物運輸方向及路徑對于促進鱗莖內糖的積累和轉化，對于優質百合鱗莖和切花都具有重要的理論意義和實踐價值。

百合鱗片由表皮、薄壁組織、維管束和初生分生組織構成，在薄壁組織內分布著的維管束與表皮平行排列成1排，并且鱗片中部維管束大且分布稀疏，至兩邊維管束變小且分布密集，這些維管束源源不斷地為百合鱗莖的生長發育提供必需的物質。羧基熒光素(Carboxyfluoreseein)，簡稱CF，是5-和6-羧基代替的熒光素混合物，通常以酯類或以弱酸的形式進行裝載；例如5(6)羧基熒光素酯，5(6)-carboxyfluoresein diacetate(縮寫CFDA，市售商品)。當不具有熒光的膜透過性CFDA進入細胞后，便分解成膜不透過性熒光染料5(6)-CF，因而只能通過胞間連絲等共質體途徑在細胞和組織間進行轉運，因此被廣泛用作共質體轉運標記的探針，主要用于標記細胞間轉運，細胞融合，及莖和葉中共質體的連續性等方面的研究。5(6)-CF已被廣泛用來作為研究植物體內韌皮部共質體卸載和韌皮部轉運的熒光指示劑，目前己在核桃、葡萄，蘋果，梨、等果實中研究了果實發育過程中同化物由源-葉，運輸到庫-果實中的路徑和卸載，同時還用CF研究了大麥和煙草庫葉中韌皮部共質體卸載路徑，微繁組培作為多種植物尤其是百合，生產和常用體系，但離體百合鱗莖CFDA熒光染色還未有報道。通過在熒光顯微鏡下觀察CF在植株內的分布情況，就可以了解植物體內同化物運輸路徑，比傳統的顯微放射自顯影技術更安全、更簡單。