[發明專利]用于敲除CXCL12基因的腺相關病毒重組載體及其構建方法和用途

有效

• 申請號: 201811204627.3
• 申請日: 2018-10-16
• 公開（公告）號: CN109234314B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 陳意雄;蔡曉龍;鄒杰;朱鵬飛;白易鑫
• 申請（專利權）人: 漢恒生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N5/10;C12N15/66;A61K35/768;A61P35/00
• 代理公司: 常州市權航專利代理有限公司 32280
• 代理人: 黃晶晶

本發明提供一種用于敲除CXCL12基因的腺相關病毒重組載體，所述重組載體至少包括如下可操作性連接的序列元件：5’末端反相重復序列，CMV啟動子，sacas9序列，polyA信號序列，U6啟動子序列，gRNA序列，3’末端反相重復序列。經過發明人研究發現，CXCL12基因敲除載體可以有效抑制U87細胞膠質瘤模型的移植瘤生長及腫瘤血管生成，能夠有效抑制U87細胞裸鼠皮下膠質瘤模型的腫瘤生長及腫瘤的血管生成。說明本發明的技術方案可以適用于膠質瘤疾病的治療。

技術領域

本發明涉及一種用于敲除CXCL12基因的腺相關病毒重組載體及其構建方法和用途，屬于生物技術領域。

背景技術

CXCL12又稱基質細胞衍生因子－1(SDF-1)是小分子的細胞因子，屬于趨化因子蛋白家族。CXCL12與其受體(CXCR4)在很多生理和病理的發生發展中發揮重要的作用，在腫瘤中通過不同途徑使細胞內信號發生改變，能夠促進腫瘤細胞的增殖、運動、粘附、侵襲。影響腫瘤的發生、發展和預后。

腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)，是微小病毒科依賴病毒屬，病毒顆粒大小約為20～26nm，完整的生活周期需要輔助病毒(通常為腺相關病毒或皰疹病毒)參與。它編碼兩個末端的反向重復序列(ITR)中的cap和rep基因。其中cap基因編碼病毒衣殼蛋白，rep基因參與病毒的復制和整合。AAV有多種血清型，不同血清型對不同組織的親和力不同，適用于各種體內感染實驗。由于AAV的安全性能好和表達時效長的優點，目前已成為最有前景的基因治療工具。人2型腺相關病毒伴隨病毒(AAV-2)的基因組為4681個核苷酸的單鏈DNA，全部序列已測定。正鏈和負鏈DNA均可被包裝到AAV病毒顆粒中。基因組的兩末端為145bp的倒轉末端重復序列(inverted terminal repeat,ITR)。ITR序列之間為AAV病毒的編碼區，左側的ORF編碼4種Rep蛋白；右側的ORF編碼3種Cap蛋白。Cap基因編碼衣殼蛋白，其轉錄從p40啟動子開始，形成約2.6kb和2.3kb mRNA,拼接后分別編碼三個結構蛋白VP1、VP2和VP3，分子量分別為87、73和61kDa，在成熟毒粒中的比例為1:1:10。沒有VP1時，VP2和VP3就可以包裝子代單鏈DNA。但這樣的毒粒感染性較低，提示VP1在病毒顆粒的穩定性或感染性上是需要的。VP2在病毒樣空顆粒的裝配中起重要作用。VP3似乎需要與其它兩個中的一個一起，完成核定位任務。

近年來，AAV載體在臨床試驗上的安全性和良好治療效果使人們對AAV載體的研究和開發充滿了信心。隨著AAV載體的研究和開發不斷深入，其在基因治療中存在的免疫原性、靶向性不強和轉導效率不高等問題，通過改造AAV外殼蛋白，利用藥物制劑、生物材料等方法也得到了一定的解決。日前歐洲監管機構建議批準由荷蘭uniQure公司研制和申報的基因治療藥物Glyber上市。

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)是近期出現的一種由RNA指導的Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術。在這一系統中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點切斷雙鏈DNA。在基因組編輯過程中，tracrRNA和crRNA可以融合成為1條RNA(sgRNA)表達同樣可以起到靶向剪切的作用。

1971年，Judah Folkman博士首次提出了“腫瘤生長依賴于血管生成(tumorangiogenesis)”的觀點：一旦腫瘤發生，任何數量的腫瘤細胞增加，都必將伴有新毛細血管的形成。新生血管通過灌注形式為腫瘤細胞生長提供營養供給，同時它也是腫瘤細胞代謝產物排泄的有效途徑；而在沒有血管形成的情況下，腫瘤的營養供給及代謝物排泄僅能靠簡單的物理彌散。這就是嚴重地限制了腫瘤細胞的生長。