[發(fā)明專利]一種直接PCR法及其在甘藍雜交種遺傳育種中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811203531.5
• 申請日: 2018-10-16
• 公開（公告）號: CN109234372B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張偉;李建斌;王神云;余方偉;于利;唐君;王紅
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6895
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

本發(fā)明公開了一種直接PCR法及其在甘藍雜交種遺傳育種中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的直接PCR擴增方法是將甘藍種子發(fā)芽4?5天后取下胚軸直接作為模板，采用預(yù)混抗Taq DNA聚合酶抗體的DNA聚合酶通過熱啟動法進行PCR擴增的方法。本發(fā)明所提供的直接PCR擴增方法簡單、快速、實用性強，獲得的PCR檢測結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強，并且與傳統(tǒng)的將種子發(fā)芽后取幼嫩葉片進行DNA的提取和PCR檢測的方法相比，避免了提取DNA的繁雜步驟，大大地減少了檢測成本和檢測時間。本發(fā)明在甘藍“蘇甘20”雜交種遺傳純度鑒定方面具有很大的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種直接PCR法及其在甘藍雜交種遺傳育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

結(jié)球甘藍(Brassica oleracea var.capitata L.)簡稱甘藍，屬于十字花科蕓薹屬甘藍種中頂芽能形成葉球的變種，是我國重要的十字花科蔬菜之一。其營養(yǎng)豐富，適應(yīng)性及抗逆性均較強，全國各地普遍種植，在蔬菜供應(yīng)中具有舉足輕重的地位。

目前，生產(chǎn)中推廣的甘藍品種大多數(shù)是雜交種，雜交種的生產(chǎn)主要是利用雄性不育系和自交不親和系制種。但是在其制種過程中，常常由于雄性不育系能產(chǎn)生少量花粉以及自交不親和系親和指數(shù)的問題會導(dǎo)致母本自交產(chǎn)生的假雜種常混雜于F_l中，降低了種子的質(zhì)量和純度，進而給生產(chǎn)帶來不必要的損失。因此，在雜交種用于銷售和生產(chǎn)之前，對雜交種遺傳純度的鑒定是及其重要的。目前，雜交種真實性及純度的鑒定方法主要有田間形態(tài)鑒定法、生化標(biāo)記鑒定法和DNA分子標(biāo)記鑒定法。田間形態(tài)鑒定法不僅鑒定周期長，還易受外界環(huán)境以及檢測人員主觀判斷的影響，難以滿足大規(guī)模種子純度鑒定以及當(dāng)年生產(chǎn)需要(石星星,紀小紅,張磊,等.利用SSR標(biāo)記鑒定結(jié)球甘藍雜交種真實性及純度.分子植物育種,2015,13(2):331-337)。生化標(biāo)記鑒定法如同工酶電泳和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)其穩(wěn)定性差且位點的多態(tài)性較低，難以用于雜種純度的檢測和品種鑒定。而DNA分子標(biāo)記鑒定法不僅數(shù)量多、準(zhǔn)確、快速且不受季節(jié)環(huán)境限制，已廣泛應(yīng)用于作物種子純度鑒定(袁天成,司軍,宋洪元,等.結(jié)球甘藍西園六號種子純度的SSR和SRAP鑒定.西南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2014,36(6):41-46)。插入缺失多態(tài)性標(biāo)記(Insertion-deletion polymorphism,InDel)是在等位基因位點上一定數(shù)量的核苷酸插入或缺失而產(chǎn)生的長度多態(tài)性變異，是基于全基因組序列的新一代分子標(biāo)記，因其在基因組中的高密度分布，具有標(biāo)記特異性高、穩(wěn)定性好、檢測方法簡單、經(jīng)濟等優(yōu)點，目前成為甘藍雜交種純度鑒定的首選技術(shù)之一(朱東旭,王彥華,趙建軍,等.結(jié)球甘藍相對于大白菜連鎖群特異InDel標(biāo)記的建立及應(yīng)用.園藝學(xué)報,2014,41(8):1699-1700)。

進行常規(guī)PCR法中制備DNA模板不僅是檢測的第一步，也是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確與否的基礎(chǔ)。目前主要使用CTAB法和SDS法等方法從待測樣品中提取DNA作為PCR反應(yīng)的模板。但DNA提取的方法操作復(fù)雜，提取時間較長，同時提取液中含有的苯酚、氯仿和異戊醇等試劑易對環(huán)境造成污染。在大規(guī)模的雜交種子純度鑒定中，DNA模板的提取己成為檢測環(huán)節(jié)中花費人力、物力和財力最多的一個環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種直接PCR法。

本發(fā)明的另一目的是提供該方法在甘藍“蘇甘20”雜交種遺傳育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種直接PCR法，該方法是將甘藍下胚軸直接作為模板，采用預(yù)混抗Taq DNA聚合酶抗體的DNA聚合酶通過熱啟動法進行PCR擴增的方法。

在所述方法中，所述下胚軸優(yōu)選甘藍種子發(fā)芽4-5天后的下胚軸。

為了達到更加理想的PCR效果，在本發(fā)明的一個實施例中，所述在直接PCR反應(yīng)體系中的下胚軸優(yōu)選以截取一段長度為1-1.5mm的下胚軸的形式存在的。