[發明專利]一種直接PCR法及其在甘藍雜交種遺傳育種中的應用

有效

• 申請號: 201811203531.5
• 申請日: 2018-10-16
• 公開（公告）號: CN109234372B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發明（設計）人: 張偉;李建斌;王神云;余方偉;于利;唐君;王紅
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6895
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

1.SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物在甘藍“蘇甘20”雜交種遺傳純度鑒定中的應用，其特征在于以甘藍“蘇甘20”雜交種子發芽后的下胚軸直接為模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，采用直接PCR的方法，預混抗Taq DNA聚合酶抗體的DNA聚合酶通過熱啟動法進行PCR擴增；對擴增得到的DNA片段利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，對電泳條帶結果進行分析，將同時具有父本特異性條帶和母本特異性條帶的單株判定為真正的雜交種，缺少其中任意一個條帶的記為假雜種。

2.一種甘藍“蘇甘20”雜交種篩選方法，其特征在于包括：以甘藍“蘇甘20”雜交種子發芽后的下胚軸直接為模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，采用直接PCR的方法，預混抗Taq DNA聚合酶抗體的DNA聚合酶通過熱啟動法進行PCR擴增；對擴增得到的DNA片段利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，對電泳條帶結果進行分析，將同時具有父本特異性條帶和母本特異性條帶的單株判定為真正的雜交種，缺少其中任意一個條帶的記為假雜種。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述甘藍下胚軸為甘藍種子發芽4-5天后的下胚軸。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述甘藍下胚軸在直接PCR反應體系中是以截取一段長度為1-1.5 mm的下胚軸的形式存在的。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述甘藍下胚軸在直接PCR反應體系中的含量為每20 μ1所述PCR反應體系中含有一段長度1-1.5 mm的所述下胚軸。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的直接PCR擴增反應體系為：Tris-HCl10 mM，KCl 50 mM，MgCl₂ 1.5 mM，dNTPs 0.2 mM，上、下游引物各0.5 μM，預混抗Taq DNA聚合酶抗體的DNA聚合酶0.1 U/μl；所述的直接PCR擴增程序為：98 ℃ 3min；95 ℃30 s，54℃ 30s，72 ℃ 30s，35個循環；72 ℃ 7 min延伸；10 ℃保存。

7.一種甘藍“蘇甘20”雜交種遺傳純度快速鑒定方法，其特征在于包括：以甘藍“蘇甘20”雜交種子發芽后的下胚軸直接為模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，采用直接PCR的方法，預混抗Taq DNA聚合酶抗體的DNA聚合酶通過熱啟動法進行PCR擴增；對擴增得到的DNA片段利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，對電泳條帶結果進行分析，將同時具有父本特異性條帶和母本特異性條帶的單株判定為真正的雜交種，缺少其中任意一個條帶的記為假雜種，計算種子遺傳純度。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）采用特異引物InDel 90，上游引物：SEQ ID NO.1和下游引物：SEQ ID NO.2，以甘藍“蘇甘20”雜交種子發芽4-5天后的下胚軸為模板，采用直接PCR的方法，預混抗Taq DNA聚合酶抗體的DNA聚合酶通過熱啟動法進行PCR擴增；

（2）將擴增得到的DNA片段在濃度為6.0 %的聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，60 ml凝膠中含有：Arc : Bis（29:1） 16 ml、5×TBE 12 ml、TEMED 48 μl、10 % APS 0.75 ml和ddH₂O31.2 ml；60V電壓預電泳30min后上樣，在130V穩壓下電泳1.5~2.0 h，電泳結束后，用0.5 %冰醋酸和10 %乙醇固定液對凝膠固定15min；洗滌后用0.2 % AgNO₃溶液染色15 min；洗滌后用組成為1.5 % NaOH和1 %甲醛的顯色液顯色后，洗滌后于燈箱上拍照；

（3）對電泳條帶結果進行分析，將同時具有父本特異性條帶和母本特異性條帶的單株判定為真正的雜交種，缺少其中任意一個條帶的記為假雜種，計算種子遺傳純度。