[發(fā)明專利]一種以磁性Fe3

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811202187.8
• 申請日: 2018-10-16
• 公開（公告）號: CN109321559B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江波;曹永興;金輝;李寧;潘永勝;張濤;周煥霞
• 申請（專利權(quán)）人: 山東星光首創(chuàng)生物科技有限公司;江南大學(xué)
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/10
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種以磁性Fe₃O₄?多糖微球?yàn)檩d體固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。以兩種功能性多糖菊粉和果聚糖作為吸附劑，利用化學(xué)共沉淀方法，合成磁性Fe₃O₄?多糖微球。磁性Fe₃O₄?多糖微球能夠有效提高載體的穩(wěn)定性以及酶負(fù)載量，兼具強(qiáng)磁響應(yīng)性的優(yōu)點(diǎn)，將其應(yīng)用于果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化。固定化酶重復(fù)反應(yīng)6次后，剩余81％酶活。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種以磁性Fe₃O₄-多糖微球?yàn)檩d體固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蔗果低聚糖(Fructooligosaccharide，F(xiàn)OS)，又稱低聚果糖，分子式為：G-F-Fn，n＝1-3(G 為葡萄糖，F(xiàn)為果糖)，是由1-3個果糖基通過β-2-1糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖組成的混合物。

由于低聚果糖具有能夠有效增殖雙歧桿菌、促進(jìn)腸胃功能、熱量低、防止齲齒等有益功能，愈發(fā)受到人們青睞，故其工業(yè)化生產(chǎn)對人們身體健康以及國民經(jīng)濟(jì)化發(fā)展具有重要意義。工業(yè)上一般以蔗糖為底物利用果糖基轉(zhuǎn)移酶(Fructosyltransferase，EC2.4.1.9，F(xiàn)TS)的轉(zhuǎn)糖基作用得到低聚果糖，其反應(yīng)機(jī)理如下：

G-F(蔗糖)→G(葡萄糖)+G-F(蔗糖)+G-F-F(蔗果三糖)+G-F-F-F(蔗果四糖)+ G-F-F-F-F(蔗果五糖)

目前國內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)低聚果糖的技術(shù)主要是液體深層發(fā)酵法，這種方法發(fā)酵周期長，果糖基轉(zhuǎn)移酶利用率低。而固定化酶法是一種在工業(yè)化酶促反應(yīng)中被廣泛使用的技術(shù)。固定化酶法憑借其眾多優(yōu)點(diǎn)如酶能被反復(fù)利用、可避免被代謝產(chǎn)物污染、降低生產(chǎn)成本成為研究熱點(diǎn)。

目前固定化主要有吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合等，采用的載體包括大孔樹脂、海藻酸鈉、有機(jī)新型材料等，交聯(lián)劑的使用以及共價(jià)結(jié)合法可能造成酶的部分失活、酶催化微環(huán)境的改變，甚至導(dǎo)致其反應(yīng)動力學(xué)發(fā)生變化。簡單的吸附法不適用于大分子物質(zhì)、不適用于多酶反應(yīng)。包埋法不易于工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)，會造成產(chǎn)物與底物難分離、酶反應(yīng)難控制的現(xiàn)象。

2005年，Iraj Ghazi等將果糖基轉(zhuǎn)移酶共價(jià)固定在經(jīng)過環(huán)氧基團(tuán)活化的聚甲基丙烯酸酯聚合物上，固定化酶活達(dá)25.9U/g載體，低聚果糖濃度最高可達(dá)61.5％。但是這種固定化方法所需載體的前處理復(fù)雜，固定化酶活不高，酶活回收率有限。2014年，Ganaie等人采用殼聚糖珠和藻酸鹽珠固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，固定化酶活分別為25U/g載體和43U/g載體，所獲得的低聚果糖濃度分別是42.79％和67.75％。這種方法采用構(gòu)造穩(wěn)定的基質(zhì)對菌絲體進(jìn)行包埋，以殼聚糖珠為載體的固定化酶再循環(huán)效率低，而以藻酸鹽珠為載體的熱穩(wěn)定性還有待提高。因此，利用一些方法來幫助改善這些缺陷，應(yīng)用改善后的固定化酶法生產(chǎn)功能廣泛的有益物質(zhì)比如低聚果糖，對于固定化酶的進(jìn)一步應(yīng)用有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種以磁性Fe₃O₄-多糖微球?yàn)檩d體固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，先制備果糖基轉(zhuǎn)移酶和磁性Fe₃O₄-多糖微球，再用磁性Fe₃O₄-多糖微球固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述多糖包括菊粉或果聚糖。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述制備果糖基轉(zhuǎn)移酶的具體步驟包括：

(1)將黑曲霉發(fā)酵20-48h，抽濾收集濕菌體；

(2)用0.1-0.5mol/L、pH 5.0-7.0的檸檬酸-磷酸緩沖液清洗，所得菌體用上述緩沖液制成菌體懸浮液；

(3)破碎菌體，冷凍離心后取上清液；