[發明專利]EvaGreen法數字PCR檢測DMD拷貝數變異的引物、檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201811201193.1
• 申請日: 2018-10-16
• 公開（公告）號: CN109306375A
• 公開（公告）日: 2019-02-05
• 發明（設計）人: 李浩楠;劉曼露
• 申請（專利權）人: 上海瀚垚生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司 44259
• 代理人: 姚迎新

1.一種EvaGreen法數字PCR檢測假肥大性肌營養不良的拷貝數變異的靶標引物和內參引物，其特征在于，所述靶標引物的序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQID NO：22所示，所述內參引物的序列如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示。

2.一種非診斷目的的基于EvaGreen法數字PCR的單孔同時擴增假肥大性肌營養不良基因外顯子靶標和內參序列的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：以待測樣品的DNA為模板，進行EvaGreen法定量PCR擴增，獲得PCR擴增產物；

步驟二：檢測擴增產物的熒光信號；

其中，用于PCR擴增的反應體系中含有檢測DMD拷貝數變異的靶標引物和內參引物，所述靶標引物的序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示，所述內參引物的序列如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示。

3.如權利要求2所述的非診斷目的的基于EvaGreen法數字PCR的單孔同時擴增假肥大性肌營養不良基因外顯子靶標和內參序列的方法，其特征在于，所述擴增的條件如下：

反應體系：2X QX200ddPCR EvaGreen Supermix 10μL，DNA模板2μL，Primer Mix 2μL，去離子水6μL；其中，Primer Mix為：

濃度為20uM的靶標引物正向反向各0.25μL、濃度為20uM的內參引物正向反向各0.75ul以及18ul去離子水的混合物；

反應條件：95℃，5min；95℃，30s；60℃，60s，40循環；4℃，5min；90℃，5min；4℃。

4.一種檢測假肥大性肌營養不良的拷貝數變異的檢測試劑盒，其特征在于，含有以下試劑：

(a)檢測DMD拷貝數變異的靶標引物；

(b)檢測DMD拷貝數變異的內參引物；

其中，所述靶標引物的序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示，所述內參引物的序列如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示。

5.一種如權利要求4所述的檢測試劑盒在假肥大性肌營養不良癥篩查中的應用。

6.一種如權利要求4所述的檢測試劑盒在假肥大性肌營養不良癥的風險評估中的應用。