[發明專利]EvaGreen法數字PCR檢測DMD拷貝數變異的引物、檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201811201193.1
• 申請日: 2018-10-16
• 公開（公告）號: CN109306375A
• 公開（公告）日: 2019-02-05
• 發明（設計）人: 李浩楠;劉曼露
• 申請（專利權）人: 上海瀚垚生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司 44259
• 代理人: 姚迎新

本發明公開了一種EvaGreen法數字PCR檢測假肥大性肌營養不良的拷貝數變異的靶標引物和內參引物。本發明還公開了一種非診斷目的的基于EvaGreen法數字PCR的單孔同時擴增DMD基因外顯子靶標和內參序列的方法。同時公開了一種檢測假肥大性肌營養不良的拷貝數變異的檢測試劑盒及其應用。本發明的靶標引物和內參引物的特異性好，為快速準確檢測假肥大性肌營養不良的拷貝數變異提供了一種很好的方法。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體地說，是關于一種EvaGreen法數字PCR檢測DMD拷貝數變異的引物、檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

假肥大性肌營養不良(DMD)，也稱Duchenne型肌營養不良癥(DMD)(OMIM310200)，是最常見的一類進行性肌營養不良癥?；疾÷蕿?.3/10萬，占出生男嬰的20-30/10萬，為X-連鎖隱性遺傳。主要是男性發病，女性為致病基因的攜帶者。通常5歲左右發病。肌萎縮是進行性的，預后差，這是本病的特點。

DMD致病的主要突變形式為基因的部分缺失或重復，實現該突變形式的快速高效準確的檢測，有利于此疾病的篩查、風險評估、預防以及高危女性攜帶者篩查。

DMD基因共有79個外顯子，其中45-55號外顯子，為熱點的缺失重復突變區域，約占所有缺失重復變異的80％。實現快速高效的篩查該區域的拷貝數檢測，可以完成絕大部分患者的篩查和其子女患病風險評估。

現有的外顯子拷貝數的缺失或重復的檢測方法主要有熒光原位雜交技術(Fluorescent In Situ Hybridization,FISH)、比較基因組雜交技術(array-basedcomparative genomic hybridization,aCGH)、多重連接探針擴增技術(MultiplexLigation-dependent Probe Amplification,MLPA)、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)以及Taqman法ddPCR。然而，FISH法檢測成本昂貴，對于技術人員要求過高，通量與分辨率較低；aCGH法檢測成本高，檢測技術太過復雜；MLPA法檢測易受內參基因、不完全變性、鹽濃度等參數影響，不具備普適性；qPCR法的準確性不高，易產生假陽性；Taqman法ddPCR對于探針設計成本與要求過高，PCR反應效率相比普通PCR有所降低。

因此，提供一種成本低、誤差小、可行性高的外顯子拷貝數的缺失或重復的檢測方法具有重要的應用價值，為快速準確檢測外顯子拷貝數的缺失或重復提供技術手段和科學依據。

EvaGreen是分子探針公司核心研發團隊獨立創辦的Biotium公司的明星產品。經過美國環境安全檢測，及艾姆斯檢測安全無毒性。它是一種同時適用于實時PCR和高分辨率溶解曲線(HRM)分析的染料。由于EvaGreen在光譜特性上類似于FAM以及SYBR Green I，因此這種染料兼容所有商業化的qPCR儀器。與SYBR Green I相比，EvaGreen對PCR的抑制性更小，更不容易產生非特異性擴增，產生的熒光信號強，安全無毒，更穩定等特點。但是，現有的EvaGreen法數字PCR檢測需要正常人對照樣本，受實驗操作影響及孔間差異影響大，誤差大。

發明內容

本發明首要目的在于提供一種EvaGreen法數字PCR檢測DMD拷貝數變異的靶標引物和內參引物。本發明的第二個目的在于提供一種基于EvaGreen法數字PCR的單孔同時擴增DMD基因外顯子靶標和內參序列的方法。本發明的第三個目的在于提供一種檢測DMD拷貝數變異的檢測試劑盒及檢測試劑盒的應用。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：