[發明專利]一種高效形貌無損的外泌體分離方法

在審

• 申請號: 201811200567.8
• 申請日: 2018-10-16
• 公開（公告）號: CN109266599A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 張開翔;史進進;劉衛;張振中;岳婭樂;張俊利;吳思璇
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 蔡文雅

本發明涉及高效形貌無損的外泌體分離方法，可有效解決現有技術耗時、成本高、穩定性差、不能保證獲得外泌體的純度的問題，其解決的技術方案是，具體包括以下步驟：a、制備核酸適配體修飾的用于識別捕獲外泌體的磁珠；b、樣品的選擇和前處理；c、利用修飾有核酸適配體的磁珠識別并捕獲外泌體樣本；d、利用核酸適配體的互補鏈替換釋放外泌體；本發明外泌體分離方法有效解決了現有技術耗時、成本高、穩定性差、不能保證獲得外泌體的純度的問題，可高效得到形貌無損的外泌體，是外泌體分離方法上的創新。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是一種高效形貌無損的外泌體分離方法。

背景技術

外泌體是由活細胞分泌的，直徑為30nm～150nm的囊泡。研究表明，外泌體攜帶有豐富的生物學信息，包括蛋白質、mRNA和microRNA等物質，在細胞交流中起著至關重要的作用。此外外泌體還參與調控機體生理病理過程，越來越多的研究表明，外泌體參與形成腫瘤的前病灶，在腫瘤的發生發展和轉移過程直接相關。因此外泌體對于癌癥的臨床檢測與治療具有重大意義。當前外泌體研究仍處于初級階段，面臨的首要問題仍是如何高效無損地分離外泌體。

目前的外泌體提取方法如超高速離心法、試劑盒沉淀法、免疫共沉淀法等有著不容忽視的缺點，如耗時、成本高、穩定性差、不能保證獲得外泌體的純度等，一些方法更是面臨如何將捕獲的外泌體釋放的難題。因此，現有的外泌體分離技術不能滿足該領域研究需求，開拓新的外泌體分離方法勢在必行。

發明內容

針對上述情況，為解決現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種高效形貌無損的外泌體分離方法，可有效解決現有技術耗時、成本高、穩定性差、不能保證獲得外泌體的純度的問題。

本發明解決的技術方案是，具體包括以下步驟：

a、制備核酸適配體修飾的用于識別捕獲外泌體的磁珠：方法是，利用末端修飾有生物素的核酸適配體與表面修飾有鏈霉親和素的磁珠為反應體系共孵育，在反應體系中，磁珠濃度為1×10⁸ - 1×10⁹個/ml，核酸適配體濃度20 - 500nM，在37℃水浴中共孵育10 - 30min，孵育完成后利用圓環磁鐵進行磁分離，用pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌沉淀磁珠2-3次，以除去非特異性吸附的核酸適配體，得到修飾有核酸適配體的用于識別捕獲外泌體的磁珠；

b、樣品的選擇和前處理：樣品來源為人體液的血液、唾液、乳液、尿液或細胞培養液，其中，細胞培養液前處理：將細胞培養液以1000 r/min 速度離心8-10 min除去死細胞，將所得上清液過0.22μm濾膜，除去細胞碎片后待用；血液、唾液、乳液、尿液樣品的處理均為：將收集的樣品于3-5℃、3000r/min離心8-10min，取上清液過0.22 μm濾膜后待用；

c、利用修飾有核酸適配體的磁珠識別并捕獲外泌體樣本：將步驟a中得到的修飾有核酸適配體的用于識別捕獲外泌體的磁珠與步驟b中處理后的血液、唾液、乳液、尿液或細胞培養液樣品的其中一種置于樣品管中，37℃共孵育0.5-1h，孵育完成后，將樣品管置于圓環磁鐵上靜止3-5min沉淀，棄去上清液，用pH為7.4的PBS緩沖液洗滌沉淀兩次，得外泌體樣本；

d、利用核酸適配體的互補鏈替換釋放外泌體：將c步驟中得到的外泌體樣本重新分散于pH值為7.4的PBS緩沖液中，加入核酸適配體的完全互補鏈，使得核酸適配體完全互補鏈終濃度為1-1.5μM，于37℃共孵育0.5-1h，將孵育后的樣品管置于磁力架上靜止3-5min沉淀，吸取上清液，即得高效形貌無損的外泌體。

本發明外泌體分離方法有效解決了現有技術耗時、成本高、穩定性差、不能保證獲得外泌體的純度的問題，可高效得到形貌無損的外泌體，是外泌體分離方法上的創新。

附圖說明

圖1為本發明表面修飾有核酸適配體的磁珠識別捕獲外泌體，并通過核酸適配體完全互補鏈替換釋放出捕獲的外泌體示意圖。