[發明專利]一種高效形貌無損的外泌體分離方法

在審

• 申請號: 201811200567.8
• 申請日: 2018-10-16
• 公開（公告）號: CN109266599A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 張開翔;史進進;劉衛;張振中;岳婭樂;張俊利;吳思璇
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 蔡文雅

1.一種高效形貌無損的外泌體分離方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

a、制備核酸適配體修飾的用于識別捕獲外泌體特異標志物的磁珠：方法是，利用末端修飾有生物素的核酸適配體與表面修飾有鏈霉親和素的磁珠為反應體系共孵育，在反應體系中，磁珠濃度為1×10⁸ - 1×10⁹個/ml，核酸適配體濃度20 - 500nM，在37℃水浴中共孵育10 - 30 min，孵育完成后利用圓環磁鐵進行磁分離，用pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌沉淀磁珠2-3次，以除去非特異性吸附的核酸適配體，得到修飾有核酸適配體的用于識別捕獲外泌體特異標志物的磁珠；

b、樣品的選擇和前處理：樣品來源為人體液的血液、唾液、乳液、尿液或細胞培養液，其中，細胞培養液前處理：將細胞培養液以1000r/min 速度離心8-10min除去死細胞，將所得上清液過0.22μm濾膜，除去細胞碎片后待用；血液、唾液、乳液、尿液樣品的處理均為：將收集的樣品于3-5℃、3000r/min離心8-10min，取上清液過0.22 μm濾膜后待用；

c、利用修飾有核酸適配體的磁珠識別并捕獲外泌體樣本：將步驟a中得到的修飾有核酸適配體的用于識別捕獲外泌體的磁珠與步驟b中處理后的血液、唾液、乳液、尿液或細胞培養液樣品的其中一種置于樣品管中，37℃共孵育0.5-1h，孵育完成后，將樣品管置于圓環磁鐵上靜止3-5min沉淀，棄去上清液，用pH為7.4的PBS緩沖液洗滌沉淀兩次，得外泌體樣本；

d、利用核酸適配體的互補鏈替換釋放外泌體：將c步驟中得到的外泌體樣本重新分散于pH值為7.4的PBS緩沖液中，加入核酸適配體的完全互補鏈，使得核酸適配體完全互補鏈終濃度為1-1.5μM，于37℃共孵育0.5-1h，將孵育后的樣品管置于磁力架上靜止3-5min沉淀，吸取上清液，即得高效形貌無損的外泌體。

2.根據權利要求1所述的高效形貌無損的外泌體分離方法，其特征在于，所述的步驟a中，表面修飾有鏈霉親和素的磁珠粒徑為100-1000nm。

3.根據權利要求1所述的高效形貌無損的外泌體分離方法，其特征在于，所述的步驟a中，得到的修飾有核酸適配體的用于識別捕獲外泌體特異標志物的磁珠在使用前先用0.01%的BSA溶液封閉30min，從而降低對外泌體的非特異性吸附。

4.根據權利要求1所述的高效形貌無損的外泌體分離方法，其特征在于，所述的步驟d中，利用核酸適配體的完全互補鏈釋放外泌體時，pH值為7.4的PBS緩沖液中含有5mM的Mg^2＋，有利于堿基互補配對形成DNA雙鏈，從而競爭釋放出被捕獲的外泌體。

5.根據權利要求1所述的高效形貌無損的外泌體分離方法，其特征在于，所述的末端修飾有生物素的核酸適配體與表面修飾有鏈霉親和素的磁珠的比例為5 - 20:1。

6.根據權利要求1所述的高效形貌無損的外泌體分離方法，其特征在于，所述的外泌體樣本與核酸適配體的完全互補鏈的比例為1:20 - 100。

7.根據權利要求1所述的高效形貌無損的外泌體分離方法，其特征在于，所述的分離外泌體的特異標志物為表面蛋白或多糖或腫瘤外泌體的特異標志物。

8.根據權利要求1所述的高效形貌無損的外泌體分離方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

a、制備核酸適配體修飾的用于識別捕獲外泌體特異標志物的磁珠：方法是，利用3’-末端修飾生物素的anti-CD63核酸適配體5’-CAC CCC ACC TCG CTC CCG TGA CAC TAA TGCTAT TTT TTTTTTTTTTTT - 3’-Biotin與表面修飾有鏈霉親和素的磁珠為反應體系共孵育，在500μL反應體系中，磁珠濃度為1×10⁸個/ml，核酸適配體濃度200nM，在37℃水浴中共孵育15 min，孵育完成后利用圓環磁鐵進行磁分離，用pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌沉淀磁珠3次，每次500μL，以除去非特異性吸附的核酸適配體，得到修飾有anti-CD63核酸適配體的磁珠；

b、樣品的選擇和前處理：將MCF-7細胞培養液以1000r/min 速度離心10min除去死細胞，將所得上清液過0.22μm濾膜，除去細胞碎片后待用，上清中NTA定量外泌體濃度為1×10¹⁰個/ml；

c、利用修飾有anti-CD63核酸適配體的磁珠識別并捕獲外泌體樣本：將步驟a中得到的修飾有anti-CD63核酸適配體的磁珠與步驟b中處理后的500μL MCF-7上清液置于樣品管中，37℃共孵育0.5h，孵育完成后，將樣品管置于圓環磁鐵上靜止4min沉淀，棄去上清液，用500μL pH為7.4的PBS緩沖液洗滌沉淀兩次，得外泌體樣本；

d、利用核酸適配體的互補鏈替換釋放外泌體：將c步驟中得到的外泌體樣本重新分散于500 μL pH值為7.4的PBS緩沖液中，加入anti-CD63核酸適配體的完全互補鏈3’-GTG GGGTGG AGC GAG GGC ACT GTG ATT ACG ATA AAA AAAAAAAAA AAA - 5’， 使得核酸適配體完全互補鏈終濃度為1μM，于37℃共孵育0.5h，將孵育后的樣品管置于磁力架上靜止3min沉淀，吸取上清液，即得高效形貌無損的MCF-7外泌體。