[發(fā)明專利]一種非動(dòng)物源性樹鼩精子體外獲能液及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811200096.0
• 申請(qǐng)日: 2018-10-16
• 公開（公告）號(hào): CN109182255A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李亞輝;楊明華;李雪;宋文菲;解道豪;吳文靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/076
• 分類號(hào): C12N5/076
• 代理公司: 北京名華博信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11453
• 代理人: 李中強(qiáng)

本發(fā)明涉及一種非動(dòng)物源性樹鼩精子體外獲能液及其應(yīng)用，屬于動(dòng)物生殖生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體步驟為：配制樹鼩洗精液和獲能液；分離并取出樹鼩附睪尾，將附睪尾置于含洗精液的離心管中，孵育10min讓精子游出；將精子懸液轉(zhuǎn)移至滅菌后的離心管中，加入洗精液，輕輕混勻，離心；棄上清，再加入洗精液，離心；棄上清，加入獲能液重懸精子，使精子的濃度為10×10⁶個(gè)/mL；將上述精液分到5ml孵育管中，放入CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本發(fā)明方法采用無動(dòng)物源性成分獲能液進(jìn)行樹鼩精子體外獲能的操作，避免了體外獲能或體外受精系統(tǒng)中引入致病性因子的風(fēng)險(xiǎn)，且易于對(duì)獲能液進(jìn)行質(zhì)控。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物生殖生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種非動(dòng)物源性樹鼩精子體外獲能液及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

人及哺乳動(dòng)物精子在剛射出或從附睪尾部取出時(shí)雖然具有運(yùn)動(dòng)能力，但還不能立刻和卵細(xì)胞結(jié)合，需要在雌性生殖道中停留一段時(shí)間，發(fā)生一系列生理生化變化才具備使卵細(xì)胞受精的能力，這種現(xiàn)象稱為“精子獲能”。大量研究表明，精子獲能是所有哺乳動(dòng)物精子受精前必須經(jīng)歷的一個(gè)生理階段。

早期的精子獲能研究，采用體內(nèi)獲能的方法，即從交配后的雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)取出精子用于受精，借以分析獲能的部位、時(shí)程及其機(jī)制。但這種對(duì)體內(nèi)獲能的研究常常受到許多條件的限制，例如，精子在體內(nèi)總是與雌性生殖道分泌物接觸，而雌性生殖道中存在著影響獲能的因子，人們很難控制這種復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境，因而給研究精子獲能帶來極大的困難。

為此，體外獲能的研究方法應(yīng)運(yùn)而生。早期研究精子體外獲能通常使用各種動(dòng)物的體液(如輸卵管液、濾泡液和血清)，而這些體液的成分相對(duì)復(fù)雜，很難確定何種成分參與誘發(fā)或支持精子獲能。自從Toyoda和Chang最先報(bào)道了采用一種特定的化學(xué)培養(yǎng)液成功實(shí)現(xiàn)體外受精以來，研究精子體外獲能已變得相對(duì)容易?，F(xiàn)在，體外獲能技術(shù)可以精確地控制實(shí)驗(yàn)條件，逐個(gè)分析獲能及其相關(guān)因子，由體外獲能的研究結(jié)果可以揭示體內(nèi)獲能的本質(zhì)。最使人類受益的是，體外獲能的成功直接導(dǎo)致了目前廣泛應(yīng)用于不育癥治療的試管嬰兒技術(shù)的誕生。然而，迄今為止，所有動(dòng)物精子的體外獲能，幾乎無一例外都需要較高濃度的牛血清白蛋白(BSA)，一般認(rèn)為，BSA的作用是移除精子膜中的膽固醇，使精子質(zhì)膜的流動(dòng)性改變，對(duì)Ca²⁺和HCO₃^-的通透性增加，致使精子腺苷酸環(huán)化酶活性增強(qiáng)，cAMP的含量升高，精子蛋白酪氨酸磷酸化增加，最終導(dǎo)致精子獲能及超激活運(yùn)動(dòng)的發(fā)生，這些都是精卵正常結(jié)合與受精的前提條件。但是，動(dòng)物源性物質(zhì)BSA的應(yīng)用存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)，它不僅會(huì)給獲能或體外受精系統(tǒng)帶來一些致病性因子(如病毒、細(xì)菌、真菌、朊蛋白等)，而且也不容易對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，故此，有必要進(jìn)行非動(dòng)物源性成分獲能液的研發(fā)。

樹鼩隸屬于攀鼩目，是外形類似于松鼠的一類小型哺乳動(dòng)物，盡管人類對(duì)樹鼩的研究已有200年的歷史，但直到20世紀(jì)80年代樹鼩作為模型動(dòng)物在生物學(xué)方面的研究才引起較多的關(guān)注，樹鼩在生理解剖、神經(jīng)發(fā)育、心理應(yīng)激等方面與靈長(zhǎng)類，甚至人類高度相似，而且它們還具有體型小、生殖周期短、繁殖快、飼養(yǎng)成本低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究的諸多領(lǐng)域?，F(xiàn)在，越來越多的有識(shí)之士認(rèn)為樹鼩是最有望于替代珍貴的靈長(zhǎng)類動(dòng)物之新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，開展其精子獲能的研究有利于該動(dòng)物體外受精及人工繁殖技術(shù)的發(fā)展，但關(guān)于樹鼩精子獲能的研究目前未見報(bào)道，而且，非動(dòng)物源性成分獲能液的研發(fā)因極富挑戰(zhàn)性也未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

為克服背景技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供一種樹鼩精子體外獲能的方法，為了杜絕體外獲能或體外受精系統(tǒng)中引入致病性因子的風(fēng)險(xiǎn)，易于對(duì)獲能液進(jìn)行質(zhì)控，本發(fā)明方法采用無動(dòng)物源性成分獲能液進(jìn)行樹鼩精子體外獲能的操作，為深入研究樹鼩精子獲能的分子機(jī)理奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明是通過如下步驟實(shí)施的：