[發明專利]一種對PRRSV易感的豬子宮內膜上皮細胞系及其構建方法

在審

• 申請號: 201811199429.2
• 申請日: 2018-10-16
• 公開（公告）號: CN109486769A
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 蘇峰;張康;姜運良;葛利江;劉海昌;胡棟;王棟;劉營;張紅焱
• 申請（專利權）人: 山東農業大學;寧波德方元生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

本發明公開了一種對PRRSV易感的豬子宮內膜上皮細胞系及其構建方法，是以豬子宮內膜上皮細胞作為宿主細胞，轉染帶有SV40T抗原基因的慢病毒表達質粒，經Puromycin藥物篩選、細胞擴大培養后獲得。本發明構建的豬子宮內膜上皮細胞系具有無限傳代的功能，且能維持豬子宮內膜上皮細胞的特性，在傳代過程中能夠保持核型正常，不存在染色體結構和數目的變化；而且，該豬子宮內膜上皮細胞系對PRRSV病毒敏感，可以用于PRRSV的傳代以及相關的研究。

技術領域

本發明涉及轉基因技術領域，具體涉及一種對PRRSV易感的豬子宮內膜上皮細胞系及其構建方法。

背景技術

豬繁殖與呼吸障礙綜合癥，又叫豬藍耳病，在豬的生產過程中造成巨大損失。該病由豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒(PRRSV)引起。該病只感染豬，其他動物不會感染此病毒，而且各個年齡和品種的豬都可以感染此病毒，其中以懷孕母豬和一月內的仔豬最為易感。臨床上以妊娠母豬流產和胎兒的早產為特征性癥狀。前期研究表明，感染了PRRSV病毒的胎兒會因為胎盤細胞的凋亡而造成流產。而子宮內膜與胎兒胎盤對于妊娠的建立和維持起著重要作用。有研究提出，胎兒的細胞膜，母體的子宮內膜上皮細胞的凋亡與妊娠的終止和失敗有重要的關系。但受限于豬子宮內膜上皮細胞在每一次發情周期中的不斷變化，迄今為止，豬的子宮內膜上皮細胞系仍然沒有成功建立。

在前期細胞系的建立方法中，端粒酶和SV40大T抗原的方法是兩種最常見的方法。端粒酶的方法是基于端粒的延長從而達到細胞系構建的目的，端粒酶的構建方式更有利于維持構建好的細胞系的生物學特性。但受限于子宮內膜上皮細胞的傳代次數，目前利用端粒酶的技術來構建尚不成熟。而SV40大T抗原細胞系的構建方法則是使細胞向腫瘤化轉變從而達到細胞系的構建條件，但SV40大T抗原方法構建的細胞系在長期傳代的過程中，可能會伴有核型的改變。

由于至今仍沒有治療豬藍耳病的特效藥，所以疫苗成為控制PRRSV爆發及傳播的有效方法和主要手段。PRRSV具有很強的宿主細胞嗜性，目前用于分離和培養PRRSV的細胞主要是豬肺泡巨噬細胞(PAM)和非洲綠猴腎細胞(Marc-145)，但PAM并不是與子宮和胎盤相關的細胞；Marc-145來源于猴，而非豬來源細胞，會導致PRRSV體外研究受限于不能反應自然宿主細胞的感染情況。因此，亟需構建新的PRRSV易感的豬來源的子宮內膜上皮細胞系，以模擬PRRSV感染自然宿主細胞的過程，擴大研究范圍。

發明內容

針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種對PRRSV易感的豬子宮內膜上皮細胞系及其構建方法。本發明構建的豬子宮內膜上皮細胞系具有無限傳代的功能，且能維持豬子宮內膜上皮細胞的特性，在傳代過程中能夠保持核型正常，不存在染色體結構和數目的變化；而且，該豬子宮內膜上皮細胞系對PRRSV病毒敏感，可以用于PRRSV的傳代以及相關的研究。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種對PRRSV易感的豬子宮內膜上皮細胞系，是以豬子宮內膜上皮細胞作為宿主細胞，轉染帶有SV40T抗原基因的慢病毒表達質粒，經Puromycin藥物篩選、細胞擴大培養后獲得。

優選的，所述慢病毒表達質粒包含：SV40大T抗原基因、抗生素篩選基因Puro基因和EGFP基因。

更優選的，所述慢病毒表達質粒為pLVX-EGFP-T2A-Puro-SV40T。

本發明的第二方面，提供上述豬子宮內膜上皮細胞系的構建方法，包括以下步驟：

(1)獲得原代豬子宮內膜上皮細胞，并進行培養；

(2)以pLVX-EGFP-T2A-Puro-SV40T作為慢病毒載體，以psPAX2和pCMV-VSV-G作為輔助包裝載體，獲得慢病毒顆粒；

(3)采用慢病毒顆粒轉染培養后的原代豬子宮內膜上皮細胞；