[發明專利]一種對PRRSV易感的豬子宮內膜上皮細胞系及其構建方法

在審

• 申請號: 201811199429.2
• 申請日: 2018-10-16
• 公開（公告）號: CN109486769A
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 蘇峰;張康;姜運良;葛利江;劉海昌;胡棟;王棟;劉營;張紅焱
• 申請（專利權）人: 山東農業大學;寧波德方元生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

1.一種對PRRSV易感的豬子宮內膜上皮細胞系，其特征在于，是以豬子宮內膜上皮細胞作為宿主細胞，轉染帶有SV40T抗原基因的慢病毒表達質粒，經Puromycin藥物篩選、細胞擴大培養后獲得。

2.根據權利要求1所述的豬子宮內膜上皮細胞系，其特征在于，所述慢病毒表達質粒包含：SV40大T抗原基因、抗生素篩選基因Puro基因和EGFP基因。

3.根據權利要求2所述的豬子宮內膜上皮細胞系，其特征在于，所述慢病毒表達質粒pLVX-EGFP-T2A-Puro-SV40T。

4.權利要求1-3任一項所述的豬子宮內膜上皮細胞系的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)獲得原代豬子宮內膜上皮細胞，并進行培養；

(2)以pLVX-EGFP-T2A-Puro-SV40T作為慢病毒載體，以psPAX2和pCMV-VSV-G作為輔助包裝載體，獲得慢病毒顆粒；

(3)采用慢病毒顆粒轉染培養后的原代豬子宮內膜上皮細胞；

(4)慢病毒顆粒轉染豬子宮內膜上皮細胞后，在含血清的DMEM/F12培養液中添加終濃度為2μg/ml的Puromycin進行細胞篩選，獲得陽性細胞；

(5)將篩選的陽性細胞用不含Puromycin的培養液擴大培養，即構建得到對PRRSV易感的豬子宮內膜上皮細胞系。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟(1)中，獲得原代豬子宮內膜上皮細胞及培養的方法為：采集豬子宮內膜，將豬子宮內膜剪碎成小的組織碎片，直接接種至細胞培養皿，不加培養液放入培養箱中10-20min；取出后加入少量培養液，繼續培養箱中培養，4h后補液至沒過組織塊，同時添加青霉素和鏈霉素，隔天換液一次；

優選的，所述青霉素的加入量為100U/ml，鏈霉素的加入量為100μg/ml。

6.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟(2)中，將pLVX-EGFP-T2A-Puro-SV40T、psPAX2和pCMV-VSV-G共同轉染進入293T細胞，48h后收獲上清；72h后收獲上清和細胞，并與之前收獲的上清混合，反復凍融使細胞破裂，過濾，收集上清液，將上清液與PEG8000混合，沉降過夜，離心，去除上清，將沉淀用DMDM培養液溶解，即獲得慢病毒顆粒。

7.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟(3)中，待原代豬子宮內膜細胞培養至第七天時，進行慢病毒顆粒轉染。

8.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟(3)中，在進行慢病毒轉染時，同時加入5μg/ml的polybrene。

9.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟(5)中，將篩選的陽性細胞用不含Puromycin的培養液擴大培養50代以上。

10.權利要求1-3任一項所述的豬子宮內膜上皮細胞系在分離和/或培養PRRSV中的應用。