[發(fā)明專利]一種鑒別長柄扁桃、蒙古扁桃和榆葉梅的分子標(biāo)記引物及方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201811194935.2 | 申請日： | 2018-10-15 |
| 公開（公告）號： | CN108998567B | 公開（公告）日： | 2022-05-13 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 包文泉;敖敦 | 申請（專利權(quán)）人： | 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京冠榆知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11666 | 代理人： | 朱亞琦;趙慧 |
| 地址： | 010020 內(nèi)蒙古自*** | 國省代碼： | 內(nèi)蒙古;15 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 鑒別 扁桃 蒙古 榆葉梅 分子 標(biāo)記 引物 方法 | ||
1.一種鑒別長柄扁桃、蒙古扁桃和榆葉梅的方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）葉片樣本的采集；
（2）葉片樣本總基因組DNA的提取；
（3）利用鑒別長柄扁桃、蒙古扁桃和榆葉梅的分子標(biāo)記引物，對步驟（2）中的葉片樣本總基因組DNA中的目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
鑒別長柄扁桃、蒙古扁桃和榆葉梅的分子標(biāo)記引物，包括正向引物和反向引物；
所述正向引物tKF的序列：ACTCGAACCCGGAACTAG，
所述反向引物tKR的序列：CGACCGATTTCTGCGTAT；
所述目標(biāo)基因?yàn)椋簍rnK-UUU；
（4）對步驟（3）中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化和測序；
（5）對步驟（4）中測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，
用GENEDOC和DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對，獲得長柄扁桃、蒙古扁桃和榆葉梅的堿基差異，進(jìn)行物種間的鑒別；
將長柄扁桃、蒙古扁桃和榆葉梅的堿基差異作為鑒別種質(zhì)的分子標(biāo)記，長柄扁桃、蒙古扁桃和榆葉梅的堿基差異如下：
（1）在所述擴(kuò)增產(chǎn)物的第75個(gè)堿基位置處長柄扁桃葉片樣本群和榆葉梅葉片樣本群有堿基A的插入，而蒙古扁桃在此處有堿基A的缺失；
（2）在所述擴(kuò)增產(chǎn)物的第246堿基位置處長柄扁桃葉片樣本群有堿基ATAGAAATAAATGCAAATTTTTT的插入，而蒙古扁桃葉片樣本群和榆葉梅葉片樣本群在此處有堿基ATAGAAATAAATGCAAATTTTTT的缺失；
（3）在所述擴(kuò)增產(chǎn)物的第292堿基位置處長柄扁桃葉片樣本群的堿基為G，而蒙古扁桃葉片樣本群和榆葉梅葉片樣本群在此處的堿基為T；
（4）在所述擴(kuò)增產(chǎn)物的第358堿基位置處長柄扁桃葉片樣本群和榆葉梅葉片樣本群的堿基為T，而蒙古扁桃葉片樣本群在此處的堿基為C；
（5）在所述擴(kuò)增產(chǎn)物的第429堿基位置處長柄扁桃葉片樣本群和榆葉梅葉片樣本群的堿基為A，而蒙古扁桃葉片樣本群在此處的堿基為G。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別長柄扁桃、蒙古扁桃和榆葉梅的方法，其特征在于，在步驟（1）中，采集各地區(qū)鮮嫩、健康和無病蟲害的長柄扁桃、蒙古扁桃和榆葉梅的葉片樣本，組成長柄扁桃葉片樣本群、蒙古扁桃葉片樣本群和榆葉梅葉片樣本群。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別長柄扁桃、蒙古扁桃和榆葉梅的方法，其特征在于，在步驟（2）中，通過植物DNA快速提取試劑盒，提取長柄扁桃葉片樣本、蒙古扁桃葉片樣本和榆葉梅葉片樣本的總基因組DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別長柄扁桃、蒙古扁桃和榆葉梅的方法，其特征在于，在步驟（3）中，
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：為20uL的混合體系，包括0.2μL的2×Taq Plus Master Mix，1μL的葉片樣本總基因組DNA，2μL的10×buffer， 0.5μL的正向引物， 0.5μL反向引物，0.5μL的dNTP， 0.5μL的 DMSO 和14.8μL 的無菌去離子水ddH2O；所述葉片樣本總基因組DNA的濃度為10～20 ng·μL-1，正向引物和反向引物的濃度均為0.8μmol·L-1，dNTP的濃度為0.25mol·L-1，DMSO的質(zhì)量含量為10%；
PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>
（P-1）95℃預(yù)變性5 min，
（P-2）95℃變性30s，
（P-3）52℃退火30s，
（P-4）72℃延伸30s，
（P-5）步驟（P-1）到步驟（P-4）循環(huán)30次，
（P-6）72℃終延伸5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒別長柄扁桃、蒙古扁桃和榆葉梅的方法，其特征在于，在步驟（4）中，用DNA 分析儀對步驟（3）中得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
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