[發明專利]一種優化的臨床用TCM分選、誘導培養和質量控制鑒定試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201811194036.2
• 申請日: 2018-10-15
• 公開（公告）號: CN109266607A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 路春光
• 申請（專利權）人: 路春光
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12Q1/02;A61K35/17;A61P35/00;A61P31/12;A61P31/06;A61P31/18
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1.一種臨床用TCM分選試劑盒或CD8T+細胞分選試劑盒、TCM誘導活化及產品

量控制鑒定的試劑盒體系，其特征在于，包含人體外周血TCM分選或CD8T+細胞分選試劑盒、TCM誘導培養試劑盒和產品鑒定試劑盒，從外周血單個核細胞分選的免疫細胞，其特征在于將新鮮分離的全血或者經過凍存后復蘇的外周血單個核細胞通過CD8T+細胞分選試劑盒或TCM分選試劑盒獲得CD8+T細胞或CD8+CD62L+CD45RO+細胞：

（1）人體TCM分選試劑盒或CD8T+細胞分選試劑盒包括：CD8重力柱，Reagent1：CD8純化試劑，由CD8Fab-Strep和Buffer CI構成；Reagent2：CD62L+純化試劑，由CD62L+Fab-Strep和Buffer IS構成； Reagent3：CD45RA-純化試劑，由CD45RA-Fab-Strep和Buffer IS構成；Reagent4：Strep-Tactin Magnetic Microbeads.Reagent5：洗脫液，由D-biotin和BufferIS構成，試劑耗材在符合GMP標準條件下包裝于容器中；

（2）TCM誘導培養試劑盒，包括容器和裝入容器中的臨床用TCM細胞無血清擴增完全培養液TCM-I和TCM細胞擴增包被液TCM-II和誘導因子組合物TCM-III：

臨床用無血清TCM細胞擴增完全培養液TCM-I，含有人體細胞生長必須的碳水化合物、促生長因子和激素、維生素、人血白蛋白、氨基酸、無機鹽離子、微量元素、水、人白介素-2和人白介素15，本發明不排除可以采用上述無血清完全培養基之外的培養基實施培養；

TCM細胞擴增包被液TCM-II，它含有重組人纖維蛋白片段和PBS，重組人纖維蛋白片段的工作濃度為12.5ug/ml-50ug/ml；

TCM細胞誘導因子組合物TCM-III，無血清TCM細胞擴增完全培養液TCM-I中添加300-2000u/mL 人干擾素γ、50-200ng/mLCD3單抗、50-200ng/mLCD28單抗、50-200u/mL人白介素1α、30IU/mL白介素7、30IU/mL人白介素15、500-2000u/mL IL-2；

優選步驟TCM按照細胞密度1×10⁶/mL用TCM-III重懸，其中添加500u/mL IFN-γ、120u/mL IL-1α、1000u/mL IL-2、30IU/mL IL-7、30IU/mL人白介素15、80ng/mL CD3單抗、80ng/mL CD28，第二天以后用 TCM-I培養液對TCM細胞進行擴增培養，經過12-14天的擴增培養，收獲達到臨床應用標準的TCM細胞，并對細胞制劑進行內毒素、活性和表型檢測，細胞鑒定結果表明，細胞活性達到95%以上，同時含有較高比例的CD8-PE/CD62L+FITC/CD45RO-ECD、CD62L+FITC/CD45RO-ECD/CD44PE細胞；

（3）TCM分選和誘導后鑒定試劑盒，所述臨床用TCM細胞流式表型和活性鑒定試劑盒包括五組雙色抗體組合物，分別是IgG-FITC/IgG-PE/IgG-ECD、CD3-FITC/CD8-PE、CD8-PE/CD62L+FITC/CD45RO-ECD、CD62L+FITC/CD45RO-ECD/CD44PE和Annexin-FINKTC/PI，洗滌液50ml一管，固定液50ml一管；所述抗體每兩種按照體積1:1混合裝于1支棕色EP管中，每3-8ul可檢測一次，共計10-50套，所述洗滌液是磷酸鹽緩沖液；所述固定液是1%多聚甲醛；

（4）本發明還包括將上述TCM分選試劑盒、無血清TCM細胞擴增完全培養液TCM-I和TCM細胞擴增包被液體TCM-II和TCM-III裝入專用潔凈容器制備成試劑盒。